青鲫sIgZ重链基因的克隆及对嗜水气单胞菌的免疫响应

免疫球蛋白是鱼类适应性免疫中主要的效应因子之一, 研究鱼类免疫球蛋白对鱼类疾病的免疫防控尤为重要。本研究利用 PCR 与 RACE 技术克隆获得青鲫(Carassius auratus indigentiaus)分泌型免疫球蛋白 Z (secretory immunoglobulin Z, sIgZ)重链基因 cDNA 全长序列 (基因序列登录号: MZ274344.1), 青鲫 sIgZ 重链基因 cDNA 序列全长 2083 bp, 其开放阅读框长 1668 bp, 编码一条由 556 个氨基酸组成的肽链, 相对分子质量为 61.59 kD, 理论等电点为 7.03。青鲫 sIgZ 重链基因结构由 1 个可变区(VH), 4 个恒定区(CH1-CH4)以及 1 个分泌型的尾部(secretory tail, Sec tail)构成。在 GenBank 中进行同源序列检索, 青鲫 sIgZ 氨基酸序列与其他鱼类 IgZ 的相似性依次为团头鲂 (Megalobrama amblycephala) (63.17%)、草鱼(Ctenopharyngodon idella) (60.82%)、鲤(Cyprinus carpio carpio) (52.98%)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(37.06%)和金头鲷(Sparus aurata)(35.01%)。利用 MEGA 5.1 软件进行多重序列比对分析, 采用邻接法构建遗传系统进化树, 发现青鲫 sIgZ 基因与同属鲤科(Cyprinidae)鱼类的 IgZ 聚为一支, 青鲫 sIgZ 与团头鲂的 sIgZ 亲源关系最近。通过 qPCR 检测青鲫不同组织中 sIgZ 基因的表达, 发现青鲫头肾中 sIgZ 基因的表达量最高, 中肾、脾和肝脏次之。利用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对青鲫进行浸泡感染, sIgZ 在头肾、脾脏、中肾、肝、肠、鳃和皮肤中的表达水平在感染的 28 d 内先升高后降低, sIgZ 的相对表达量在黏膜免疫组织(肠和皮肤)中达到峰值的时间要早于系统免疫组织(头肾和脾脏), 肠和皮肤中 sIgZ 在峰值时的相对表达量显著高于头肾中 sIgZ 在峰值时的相对表达量, 实验结果显示, 青鲫 sIgZ 在肠和皮肤黏膜免疫组织中可能发挥重要的免疫功能。     

鲤病毒病原的感染性测定

为查明养殖鲤（Cyprinus carpio）突然大批发病死亡的原因，对鲤病样品进行了细胞攻毒、空斑测定、电镜观察，以及鱼体感染等实验。先以患病鲤的组织匀浆液，经过滤后，分别接种到草鱼鳍条细胞（GCF）、鲤上皮瘤细胞（EPC）等14种培养细胞中。利用倒置显微镜观察显示，在1-2d内，该病鱼组织匀浆液可使其中9种细胞出现典型的细胞病变。收集出现病变的细胞液（即病毒悬液），进一步进行病毒滴度检测、空斑测定和鱼体感染实验。结果显示，在GCF细胞上的病毒滴度为10^7.3TCID50／mL；在FHM，TSB和GCO等细胞中可产生直径1～4mm的圆形空斑，空斑的大小与宿主细胞的种类和接种的病毒浓度有关。通过对感染细胞制备的超薄切片和病毒负染样品进行电镜观察，显示这是一类呈典型子弹头样的弹状病毒颗粒。感染了病毒悬液的鲫和鲤先后在第2天和第3天开始出现病症，间隔1～2d后发病的鱼开始死亡，至第14天，两种感染鱼的死亡率均达到83．3％。收集人工感染后濒死的鲫和鲤，分别制备组织匀浆液，回接感染鱼类培养细胞，24h内能使其出现与原发病鲤组织匀浆液所引起的类似的细胞病变。因此证实患病鲤是由病毒病原感染所致。[中国水产科学，2006，13（4）：617—623]     

三种水生动物细胞系对两株蛙病毒敏感性的比较

利用3个不同物种的水生动物细胞系,包括爪蟾肾细胞系(A6)、大鲵胸腺细胞系(GSTC)和鲤上皮瘤细胞系(EPC),分别用沼泽绿牛蛙蛙病毒(RGV)和大鲵蛙病毒(ADRV)感染,进一步研究细胞病变显微形态、病毒滴度、细胞病变与不同感染时间的相关性等。结果显示,在光镜下可见感染病毒的细胞发生病变,A6和EPC细胞肿胀或破裂;GSTC细胞收缩或聚在一起形成多层。同种水产动物细胞系对不同蛙病毒的敏感性不同,在A6、EPC和GSTC细胞中,RGV的滴度分别为10~(3.6)、10~(5.9)和10~(6.6) TCID_(50)/m L;ADRV的滴度分别为10~(4.3)、10~(5.4)和10~(6.1) TCID_(50)/m L,表明GSTC细胞系对两种蛙病毒都更敏感。研究为后续蛙病毒致病机理提供了有用的信息和重要实验材料。     

一个与大鲵蛙病毒 (ADRV) 感染相关基因 —6R的克隆、原核表达及其产物分离

在新近报道大鲵蛙病毒(Andriasda vidianus ranaviurs,ADRV)基因组的基础上,我们对ADRV 6R进行了克隆、原核表达及其产物的分离,这是一个经生物信息分析表明与病毒感染相关的功能基因。先经PCR扩增长到711 bp的ADRV6R,构建含扩增片段的克隆质粒p MD18-T-6R。再构建原核表达质粒p ET-32a-6R,进行测序,并与水生动物蛙病毒相关基因同源序列进行比对,该扩增片段与预期一致,其编码分子量约为27 k D、含236个氨基酸的蛋白,与水产动物病毒US22蛋白家族(US22 family protein)成员有很高的同源性。然后对p ET-32a-6R进行转化、诱导表达,并利用Ni-NTA His-Bind亲和层析及不同浓度咪唑洗脱液对表达产物进行分离、电泳分析,结果显示,获得与预测分子量相符的45 k D融合蛋白(27 k D目的蛋白与18 k D His标签)。这为后续制备抗体、并开展大鲵蛙病毒与宿主的相互作用研究提供了有用的实验材料。     

急性病毒性鲫鳃出血病的病理变化

病毒性鲫(Carassius auratus)鳃出血病的突发流行可导致鱼高致死率,使中国部分养鱼场近些年受到重创。为了充分认识这种鱼病的发生发展过程,我们结合PCR、光学显微镜和透射电镜,对病鱼头肾等组织的病变及病毒分布情况进行了分析。注射自然发病鱼的组织滤液(病毒悬液),能使正常鲫感染,且出现与自然发病鲫相同的症状及高致死率;病原有典型疱疹病毒的形态特征(故称为鲫疱疹病毒,Ca HV)。经PCR扩增对已知鲤科疱疹病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因进行检测,可确定Ca HV存在于被感染鱼的肝、脾、肾和头肾组织中。对组织病理变化及不同时序进行比较,结果表明Ca HV感染会引起鲫这些组织不同程度病变,而鳃和头肾的病理变化有显著时序相关性。在头肾细胞中还观察到大量Ca HV颗粒,预示鲫头肾是Ca HV侵染和复制的主要靶器官。     

黑斑蛙歪头病的病原菌分离鉴定及其感染病理分析

本研究从具有典型歪头病症状的濒死黑斑蛙(Rana nigromaculata)肝脏中分离到一株优势菌HJS0526,以确定常德地区黑斑蛙歪头病的病原菌及分析其致病机理。通过细菌形态学、生理生化分析、16S r DNA序列比对确定HJS0526菌株为米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)。人工感染HJS0526菌株14 d后,实验组歪头症状出现率达90%以上,死亡率高于50%,感染症状和自然发病症状基本一致。药物敏感试验结果表明,菌株HJS0526对环丙沙星和氟苯尼考高度敏感,金银花和鱼腥草醇提取液对HJS0526菌株具有极好的抑制效果;组织病理学研究结果显示,HJS0526菌株感染造成黑斑蛙全身多组织器官功能障碍,特别是肝、脾、肾和肺等组织严重损伤,表现为明显充血、出血及细胞变性、坏死。米尔伊丽莎白菌对黑斑蛙具有高致病性,感染后可导致黑斑蛙多组织器官功能损伤而死亡。本研究结果可为预防和控制常德地区由米尔伊丽莎白菌引起的黑斑蛙歪头病提供科学依据。     

罗非鱼罗湖病毒ORF10蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

为了研究罗非鱼罗湖病毒(tilapia lake virus, TiLV) ORF10 蛋白的功能, 从染病莫桑比克罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏和肝脏组织中克隆获得 TiLV ORF10 基因编码序列, 并成功构建了荧光定位载体 pEGFP-ORF10 和重组表达载体 pET32a-ORF10。将荧光定位载体 pEGFP-ORF10 转染鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC), 经荧光显微镜观察, 在 EPC 的细胞核中观察到绿色荧光信号, 表明该蛋白定位于细胞核中。将重组载体 pET32a-ORF10 转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行目的融合蛋白表达, 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明, His-TiLV ORF10 融合蛋白成功表达并主要存在于上清液中。随后, 采用 Ni-NTA 亲和层析的方法纯化融合蛋白 His-TiLV ORF10, 以其为抗原多次免疫 Balb/C 小鼠, 制备多克隆抗体。蛋白印迹法(WB)分析显示, 制备的抗体可以特异性识别 His-TiLV ORF10。利用蛋白印迹法进一步对感染 TiLV 莫桑比克罗非鱼的不同来源组织进行检测, 结果显示, TiLV ORF10 蛋白在染病莫桑比克罗非鱼肌肉、脾脏、肝脏和肾脏中的表达存在较大差异, 其中以肝脏和肾脏组织表达量为最高, 脾脏次之, 肌肉中表达量最低。本研究为深入了解 TiLV ORF10 蛋白的功能和病毒侵染与致病等机理提供了重要基础。