海参内脏胶原降解酶的纯化及性质研究

针对海参自溶现象,研究海参内脏中与胶原降解相关蛋白酶的存在情况,以期了解内源性蛋白酶在海参自溶过程中发挥的作用,为解明自溶的内在机理提供理论依据。通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析、Phenyl Sepharose FF疏水柱层析及Mini Q离子交换柱层析等方法,从海参内脏中分离纯化出降解明胶的蛋白酶。利用荧光底物研究其酶学性质及其对海参体壁胶原蛋白的降解情况。结果表明,该酶最适温度为30 ℃,最适pH为7.5,可被金属蛋白酶抑制剂EDTA、EGTA完全抑制,亦可被PMSF、Pefabloc SC等丝氨酸蛋白酶抑制剂完全抑制。底物特异性表明,该酶只对金属蛋白酶荧光底物有分解作用,推测其为金属蛋白酶。该酶在4和37 ℃下均能有效地分解海参体壁胶原蛋白,表明其在海参自溶过程中起重要作用。     

皱纹盘鲍酶促溶性胶原蛋白的性质研究及抗体制备

针对加工副产物鲍鱼外套膜利用率低的现象,对鲍鱼腹足和外套膜胶原蛋白相关性质进行比较研究,以期为鲍鱼的综合加工提供一定的理论依据。本研究以皱纹盘鲍为原料分别提取得到腹足酶促溶性胶原蛋白(pepsin-soluble collagen of abalone adductor,PSC1)和外套膜酶促溶性胶原蛋白(pepsin-soluble collagen of abalone mantle,PSC2),对PSC1和PSC2相关特性进行比较分析,并利用PSC1制备得到兔抗鲍鱼胶原蛋白多克隆抗体。SDS-PAGE显示,PSC1和PSC2分子组成均为(α1)3,且α1的分子量为140 ku,与水产无脊椎动物Ⅰ型胶原蛋白特征相似。对PSC1进行肽指纹图谱分析,获得6个肽段、含75个氨基酸残基,与盘鲍螺的胶原蛋白前肽α链和欧洲鲍螺的纤维状胶原一致性分别达100%和88%,证明纯化的PSC1为胶原蛋白。氨基酸组成分析表明,PSC1和PSC2的组成基本一致,但脯氨酸和羟脯氨酸含量均低于牛酸溶性胶原蛋白。圆二色谱分析结果显示,PSC1和PSC2溶液均在220和197 nm分别有一正、负峰,具有典型胶原蛋白三股螺旋结构特征。FTIR光谱分析结果提示PSC1和PSC2具有相似的三螺旋结构。利用兔抗皱纹盘鲍PSC1多克隆抗体对皱纹盘鲍、尼罗罗非鱼、鲤和仿刺参胶原蛋白进行免疫印迹分析发现,该抗体只与皱纹盘鲍PSC1和PSC2的α、β和γ链产生反应,表明该抗体具有良好的特异性。