棘胸蛙胚胎发育观察与相关抗氧化酶活性变化研究

为解析棘胸蛙胚胎发育过程中酶活性变化特征及其对胚胎发育的影响，以全人工养殖的棘胸蛙作为繁殖亲本，采用仿生态繁殖方式获得受精卵，系统观察胚胎发育时序和特征，同时分析4个主要发育阶段抗氧化酶活性变化。试验结果表明，棘胸蛙胚胎发育过程与其他蛙类总体相似，但是也存在种特异性。其受精卵为沉黏性卵，卵径为(4.31±0.69) mm,分为动物极和植物极，其中动物极朝上，植物极朝下。在水温(24.5±0.5)℃条件下，由受精卵至出膜历时222.94 h,总积温5462.03 h·℃,至卵黄吸尽期历时288.44 h,总积温7066.78 h·℃。按照发育时序可将整个胚胎发育过程分为7个阶段24个时期。酶活性分析发现，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷丙转氨酶以及丙二醛的变化趋势基本一致，均在原肠中期酶活性降低，而谷草转氨酶却在原肠中期酶活性达到最高点，然后持续下降。此外，过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶4种酶活性均在卵黄吸尽期达最低，而丙二醛含量达到最低点为原肠中期。本试验可为棘胸蛙的繁殖生物学和高效制种技术提供基础资料。     

基于转录组测序的棘胸蛙SSR和SNP分子标记开发

【目的】基于转录组开发SSR和SNP分子标记用于评价棘胸蛙（Quasipaa spinosa）遗传多样性，为其种质资源的创新利用提供理论支撑。【方法】采用TRIzol试剂盒提取棘胸蛙肝脏、肌肉和肾脏组织总RNA，构建cDNA文库后利用Illumina HiSeq 2500测序平台进行高通量测序，通过MISA对棘胸蛙转录组测序数据进行SSR检索，并以SAMtools和VarScan v.2.2.7进行SNP查找。【结果】棘胸蛙转录组测序共获得93887条非冗余基因（Unigenes），序列总长度达91352712 bp，且所有转录组Q30均超过95.00%。在93887条Unigenes中发现33019个SSRs，其中21966条Unigenes含有SSR，6688条Unigenes含有超过1个SSR；以单核苷酸重复型SSR数最多，达25788个，且出现频率最高（27.47%）。SSR的平均长度以四核苷酸重复型最长，达35.47 bp；棘胸蛙SSR以（A/T）n为绝对优势重复基元，占总SSR的65.51%，然后依次为（C/G）_n、（AT/AT）_n、（AC/GT）n、（AG/CT）_n、（AAT/ATT）_n、（AGG/CCT）_n，分别占总SSR的12.59%、5.66%、5.55%、3.31%、1.55%和1.30%。在33019个SSRs中，核苷酸重复次数主要集中在5~25次，占总SSR的99.91%，且大部分SSR位于非编码区，仅有1633个SSRs位于编码区；长度≥12 bp的SSR共计17244个，占总SSR的58.53%。挑选120对SSR引物进行引物有效性验证，发现有57对引物扩增出单一条带，且条带大小与预期结果一致。对棘胸蛙转录组序列进行SNP检索，共发现87634个SNPs，其中，56300个SNPs属于转换位点、31334个SNPs属于颠换位点，转化/颠换比达1.80，碱基的转换频率明显高于颠换频率。【结论】利用高通量转录组测序开发棘胸蛙SSR和SNP分子标记是一种切实可行的方法，能开发出通用性较高、数量较多、覆盖性较广的分子标记。棘胸蛙具有中度偏高的遗传多样性，可作为种质材料进一步开发利用。     

4种水产消毒剂对棘胸蛙蝌蚪急性毒性研究

两栖类作为一类重要的水产养殖品种，目前养殖规模日益扩大，消毒剂的使用已不可避免。为探明常用水产消毒剂对两栖类急性毒性的影响，保障两栖类养殖中消毒剂的安全使用，选取38～39期的棘胸蛙蝌蚪作为试验材料，选择氯化钠、甲醛、高锰酸钾和聚维酮碘4种常见水产消毒剂作为试验药物，进行急性毒性试验，结果显示，4种消毒剂在24、48、72、96 h的半致死质量浓度排序均为：氯化钠>甲醛>高锰酸钾>聚维酮碘。其中氯化钠、甲醛、高锰酸钾、聚维酮碘4种药物对棘胸蛙蝌蚪96 h的半致死质量浓度分别为7145.53、16.32、3.61、2.93 mg/L,安全质量浓度分别为1949.01、4.80、0.88、1.85 mg/L。根据生态环境部发布的毒性分类标准，氯化钠和甲醛属于低毒消毒剂，而高锰酸钾和聚维酮碘属于中毒消毒剂。充分考虑剂量敏感性和使用方便性，推荐使用聚维酮碘作为消毒剂。此外由于蝌蚪对消毒剂的敏感性通常高于鱼类，因此在棘胸蛙等两栖类养殖过程中，需要减少消毒剂的使用剂量。试验结果将对两栖类的规模化养殖中消毒剂的安全使用提供依据，助力两栖类养殖业的健康发展。