原核高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的特性及应用

从已构建的PRRSV ORF7重组质粒pUCm-T-ORF7中用PCR扩增ORF7基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-ORF7并转化大肠杆菌.经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,成功表达了谷胱苷肽转移酶(GST)融合的核衣壳蛋白(N),重组N蛋白表达量约为菌体总蛋白的35%,主要以可溶的形式存在,且能形成同源二聚体.重组N蛋白经谷胱苷肽凝胶(glutathione sepharose 4B)亲和层析后得到高度纯化,并将该蛋白作为抗原建立了间接ELISA检测方法.利用该方法对某猪场76份猪血清进行检测并将结果与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果作比较,2种方法的总符合率达93.4%,检测结果之间差异不显著(P＞0.05).结果表明大肠杆菌表达的重组GST融合N蛋白具有良好的抗原性,因而有望利用该重组蛋白开发为试剂盒应用于临床PRRSV抗体的检测.     

冷藏条件下鲢鱼肌肉蛋白的变化

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法分析比较了鲢鱼在0和4℃下冷藏14 d过程中肌肉蛋白的变化情况.结果表明:在2种温度下冷藏,肌浆蛋白降解均不显著,其变化趋势基本一致;肌球蛋白重链在0℃下冷藏14 d,4℃下冷藏11 d后发生明显降解;α-辅肌动蛋白和肌动蛋白在2种温度下冷藏均呈逐渐降解的趋势,且在4℃下冷藏降解更为显著;原肌球蛋白在0和4℃下冷藏2 d后均开始降解,此后于0℃冷藏蛋白无明显变化,但于4℃冷藏11 d后降解速度加快.     

蟹类原肌球蛋白基因的克隆与表达

原肌球蛋白是甲壳类动物的主要过敏原之一。本文通过分子生物学技术方法，分别克隆得到锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明，三个基因的序列长度均为855 bp，编码284个氨基酸残基，三者氨基酸序列同源性为99.3%。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白具有很高的同源性。将锯缘青蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后，经IPTG诱导得到分子量约为61 kDa的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应，证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性，表明原肌球蛋白是蟹类的主要过敏原之一。该融合蛋白有望用于甲壳类食物过敏诊断试剂的开发与应用。