鸭梨果胶甲酯酶基因反义表达载体的构建及转化

果胶酯酶(pectin methylesterase,PME)催化细胞壁中多聚半乳糖醛酸的脱甲酯化,可以降解植物细胞壁中的果胶多糖而与果实软化有关。本研究根据白梨果胶酯酶基因PcPME4的序列,设计一对含有特定酶切位点的特异性引物,以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)cDNA为模板通过PCR扩增得到一段294bp的PME基因片段。将片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,经限制性酶切分析和测序分析证明成功构建PME基因的反义表达载体pBI121-AsPME。将pBI121-AsPME电转化农杆菌EHA105,利用含pBI121-AsPME的农杆菌工程菌液侵染鸭梨外植体后于抗性培养基中诱导愈伤组织,获得的抗性愈伤组织经PCR初步检测含有反向PME基因片段,荧光定量PCR检测结果显示受侵染的愈伤组织中PME基因表达量降低,表明反向插入的PME基因片段起到了抑制内源基因表达的效果。     

鸭梨多酚氧化酶基因CDS区的克隆及表达

以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)果皮基因组DNA为模板,根据已经发表的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)基因保守序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到鸭梨多酚氧化酶编码区序列,将此核酸序列克隆到载体pGEM-T,酶切鉴定后测序,结果表明该段序列含有1782个核苷酸,编码593个氨基酸。对鸭梨多酚氧化酶基因片段的一致性分析和进化树分析表明,该片段与沙梨(Pyrus pyrifolia,AB056680)、苹果(Malus domestica,L29450)、李(Prunuss alicina,AY866432)以及杏(Prunus armeniaca,AF020786)的一致性分别为99%、96.3%、82%和51.4%,绘制的进化树和形态学分类地位相一致。将该片段连接到表达载体pET39b上,获得的重组子命名为pET39b-PPO,热激法转化表达受体大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG进行诱导。SDS-PAGE分析表明,PPO基因在大肠杆菌中被诱导表达蛋白质相对分子质量约66ku,检测表明具有多酚氧化酶的活性。     

四棱豆肽的分离鉴定及其抗疲劳特性研究

为了探讨四棱豆肽组分的抗疲劳效果及对抗疲劳肽进行分离和鉴定,采用碱性蛋白酶对四棱豆蛋白进行酶解,经反相液相色谱分离后,得到Sample1、Sample2和Sample3 3个主要组分,分别以1.5 g/kg体重的剂量灌胃小鼠。结果表明：经游泳耐力实验,3个组分都可以延缓小鼠的游泳疲劳,但与四棱豆蛋白组相比,仅Sample3肽成分可以显著延缓小鼠的游泳疲劳,提高血浆中葡萄糖和游离脂肪酸的含量和肝糖原的水平。通过氨基酸组成分析,Sample3中富含抗氧化的疏水氨基酸（Leu、Ala、Ile、Pro、Val和Phe）,可以有效延缓由自由基引发的疲劳。经过色谱分离,得到Sample3肽成分中一个优势的小肽S1,其氨基酸序列为Gln-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn-Thr-Val,符合抗疲劳肽的特点。灌胃小鼠sample3组分和分子量小于1 000的米渣蛋白肽,疲劳前的游泳时间没有显著性差异,灌胃肽S1后的小鼠疲劳前的游泳时间显著增加。说明肽S1是一种潜在的天然抗疲劳物质。     

4种梨的多酚氧化酶基因克隆及其序列比较

以4种不同来源的梨基因组DNA为模板,根据已经发表的多酚氧化酶基因序列设计引物,利用PCR技术,克隆到了鸭梨、雪花梨、砂梨、黄冠梨约1．8kb的完整多酚氧化酶基因,将纯化后的扩增产物克隆到质粒pGEM-T veetor中,转化DH-5α菌,挑选阳性克隆进行测序。利用Clustalx软件对PPO核苷酸序列进行了同源性分析,用DNAStar软件对PPO核苷酸序列进行进化树分析,并进行部分植物PPO氨基酸的同源性分析。结果表明,4种梨多酚氧化酶基因的蛋白编码区含有1782个核苷酸,鸭梨基因已经在GenBank上登录,登录号为EU048225。梨多酚氧化酶基因与其他植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性,尤其在铜离子结合部位,所有的植物基本上一致;5种梨的同源性高达98％。基于植物PPO基因核苷酸序列的分子进化树显示,可分为两大类,梨的多酚氧化酶可以与大多数的木本植物聚合成一个组。