两种原核表达载体对CsPPO蛋白表达活性的影响

为了选择合适载体,获得稳定表达且具有高活性的可溶性茶树多酚氧化酶,本研究以茶树叶片为材料,克隆茶树多酚氧化酶基因（CsPPO）,切除含43个氨基酸和70个氨基酸的肽段后分别与pET32a载体、pMAL-c5X载体进行重组构建原核表达载体,分别命名为pET32a-CsPPO₄₃、pET32a-CsPPO₇₀、pMALc5X-Cs PPO₄₃、pMALc5X-CsPPO₇₀,利用E. coil Transetta（DE3）菌株进行表达,经SDS-PAGE电泳检验,pMAL-c5X载体表达的目的蛋白易于提取,大量出现在上清液中;而pET32a载体表达后蛋白则基本存在于沉淀中。利用邻苯二酚、ECG、EC 3种底物在410βnm处检测CsPPO蛋白活性发现,pMALc5X-CsPPO对不同底物反应时酶活性随时间增加均呈现明显“S”型变化,表明茶树PPO氧化儿茶素类的反应并不是匀速过程。pMALc5X-CsPPO₄₃比活力比pMALc5X-CsPPO₇₀的高,其中pMALc5X-CsPPO₄₃与EC反应时酶比活力最高,最大比活力为1.45×10⁶β U·mg^-1。因此,可利用pMALc5X-CsPPO₄₃合成工业用PPO,为进一步研究其与儿茶素的反应机理,利用体外酶法高效获得茶黄素奠定基础。