象草4CL基因片段的克隆及RNAi 表达载体构建

 象草是热带和亚热带地区广泛栽培的多年生资源植物。为探讨华南象草４-香豆酸：ＣｏＡ 连接酶（4CL）基因下调表达对木质素合成的影响,本研究设计１对特异引物,ＰＣＲ 扩增获得一段长为３７４ｂｐ的干扰片段。通过ＴＯＰＯ 克隆,将该片段克隆到载体ｐＣＲ ／ＧＷ／ＴＯＰＯ  ,构建了入门克隆载体ｐＥＮＴＲ-４CL;再经过ＬＲ 反应使ｐＥＮＴＲ-４CL上的干扰片段进入目的载体ｐＣＢ２００４Ｂ 上,形成表达载体ｐＣＢ２００４Ｂ-４CL,最后通过冻融法将其转入到根癌农杆菌ＥＨＡ１０５中。菌液ＰＣＲ 结果表明ＲＮＡｉ质粒已成功转入农杆菌,为进一步利用ＲＮＡｉ技术研究４CL基因的功能奠定了基础。     

象草CCR基因的克隆与生物信息学分析(英文)

[目的]从能源植物象草中克隆出参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)的cDNA序列及全长DNA序列,进而分析其序列特征。[方法]采用传统RT-PCR及RACE技术克隆象草CCR序列,并利用NCBI,ProtParam,ProtScale,TMHMM,TargetP,SignalP,Pfam20.0,Prosite,Swiss-Model和ClustalW2等在线分析程序以及DNAman,DNAstar和MEGA5软件对得到的序列进行生物信息学分析。[结果]克隆得到了象草CCR包含编码区和3’非翻译区的长为1316bp的cDNA序列以及包含5个外显子和4个内含子的全长为6133bp的DNA序列。通过生物信息学分析得知,象草CCR基因编码长为369个氨基酸的蛋白,该蛋白二级结构元件以无规则卷曲和α-螺旋为主,属于依赖NAD表异构酶/脱氢酶家族,其辅助因子结合区域和底物结合位点高度保守。[结论]成功从象草中克隆出肉桂酰辅酶A还原酶基因。它具有CCR同源基因典型的特征。获得的各种生物信息学数据为今后开展此酶的深入研究以及对象草的更好利用提供了一定的理论参考价值。     

象草不同品种木质素合成关键酶活性的动态变化

以MT-1象草(Pennisetum purpureum cv.MT-1)及其近缘品种为研究对象,通过在2008年3月、5月、7月、8月、10月和12月的6次取样,对其茎秆的苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)的酶活性动态变化规律进行研究,从而为MT-1象草新品种的推出提供帮助。结果表明:MT-1、N51、Mott和Guimu No.1象草茎秆PAL酶活性的最大值均出现在7月,Huanan象草PAL酶活性的最大值出现在5月,这与它们木质素含量的快速增长期相吻合;最小值出现的月份各不相同,又反映了品种间的差异。5个品种(系)茎秆4CL活性在5月份达到最大值,出现在木质素含量快速增长的前期(快速拔节的前期);从7月开始大幅度降低,其中MT-1、N51、Huanan和Guimu No.1象草在10月又出现一个小的峰值;Mott象草则在12月又出现一个差异不显著的小高峰,这与其延迟的成熟期密切相关。