玉米种胚内质网胁迫相关基因对人工老化处理的响应

【目的】在植物中,内质网胁迫（endoplasmic reticulum stress,ERS）和未折叠蛋白应答（unfolded protein response,UPR）参与环境胁迫响应过程,然而,玉米种子老化过程中内质网胁迫相关基因表达情况尚未见报道。文章利用基因数字表达谱技术探究玉米种子老化过程中内质网胁迫相关基因表达规律,以期为揭示种子衰老的分子机制提供理论依据。【方法】以玉米杂交种郑单958种子为材料,采用高温（45℃）高湿（相对湿度100%）的方法进行人工老化处理。分别提取未老化处理（对照）和老化处理3 d的玉米种胚总RNA,利用Illumina HiSeqTM 2000平台进行高通量测序。去除原始数据中的接头序列、包含模糊碱基的序列以及低质量序列,获得Clean reads,利用短序列比对软件SOAPaligner/ SOAP2将Clean Reads分别比对到玉米参考基因组和参考基因序列,采用RPKM（reads per kb per million reads）方法计算基因的表达量,根据FDR（false discovery rate）＜0.001和|log2 ratio(T/CK)|≥1的标准筛选差异表达的基因,对获得的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）进行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库功能注释分析,筛选出响应人工老化的内质网胁迫相关差异表达基因。利用qRT-PCR技术定量分析内质网胁迫相关基因在不同人工老化时间内的表达特性。【结果】基因数字表达谱鉴定结果表明,有104个差异表达基因在人工老化过程中参与内质网蛋白质加工（protein processing in endoplasmic reticulum）通路,其中内质网胁迫相关基因有97个（81个上调表达,16个下调表达）。对差异表达基因功能注释分析表明,内质网胁迫的标志性蛋白基因BiP以及分子伴侣蛋白基因CRT、CNT和GRP94等显著上调表达。参与内质网相关性降解（endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD）途径的有83个差异表达基因（70个上调,13个下调）,其中启动ERAD途径的关键酶基因EDEM （ER degradation enhancing mannosidase I-like protein）下调,参与蛋白泛素化的E2泛素结合酶基因UbcH5、E3泛素连接酶基因Hrd1和Doa10等也发生显著的表达变化。qRT-PCR结果表明,内质网胁迫相关基因在不同人工老化时间内表现表达多样性和复杂性。【结论】人工老化处理能造成玉米种胚细胞发生内质网胁迫。细胞通过上调分子伴侣基因表达和诱导ERAD途径响应内质网胁迫,但ERAD途径受阻可能引起错误折叠蛋白聚集,从而进一步加剧细胞损伤,最终导致种子活力降低甚至丧失。     

玉米种胚HSP20基因对人工老化处理的响应

以玉米杂交种“郑单958”为材料, 采用高温(45°C)高湿(100%相对湿度)对玉米种子进行人工老化处理, 并用转录组技术, 研究植物HSP20基因对种子人工老化处理的响应, 旨在为揭示种子衰老的分子机制提供依据。结果表明, 随着老化时间的延长, 种子活力和种胚内过氧化氢酶的活性均表现下降趋势; 过氧化氢含量在老化第3天达到最大值, 随后下降; 丙二醛含量逐渐升高; 转录组检测表明, 种子老化过程中差异显著的HSP20基因有25个, 这些基因编码的HSP20蛋白主要被定位在细胞核、线粒体、以及叶绿体上, 其序列中均含有ACD保守序列(RVDWRETPDAHEIVVDVP GMRREDLRIEVEDNRVLRVSGERRRAEERKGDH WHREERSYGRFWRRFRLPENADLDSVAASLDSGVL TVRFRK)。该序列中含有较多的Arg (11.2%)、Lys (7.2%)、Pro (4.2%)、Thr (3.9%)等氨基酸, 老化过程中积累的ROS可能氧化这些氨基酸, 导致HSP20结构破坏、功能丧失。利用qRT-PCR技术对挑选的编码细胞质、叶绿体和线粒体HSP20的基因的表达模式分析显示, 随着老化程度的加深, 2个编码细胞质HSP20的基因上调表达, 另外两个编码叶绿体和线粒体HSP20基因的表达量在老化第3天达最大值, 随后下降。推测HSP20基因对种子老化有重要作用, HSP20蛋白的ACD结构域中Arg、Lys等氨基酸的靶向氧化可能是种子衰老的主要原因之一。