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采用优化的数字PCR方法分析转基因小麦外源基因拷贝数 总被引:2,自引:0,他引:2
【目的】 探索基于数字PCR的小麦基因拷贝数分析技术,提高目标基因拷贝数的分析通量,促进小麦基因组研究及基因工程研究。【方法】 采用中国农业科学院作物科学研究所小麦抗逆分子育种课题组创制的高抗小麦黄花叶病转nib8小麦为试验材料,使用小麦D基因组中的单拷贝纯合内源基因PINb-D1b(籽粒硬度基因)为内参基因,根据转化的抗病基因nib8序列设计4对特异性引物及相应探针,通过试验确定探针和引物的最优浓度,优化体系的退火温度,寻找最合适的模板浓度。然后用数字PCR检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数;同时用Real-time PCR和Southern blot 2种不同方法分析的拷贝数结果,验证上述采用数字PCR方法分析拷贝数的准确性;以PINb-D1b内参基因检测Wx012(蜡质基因)和SSII(淀粉合成基因)2个内参基因的拷贝数,以Wx012和SSII为内参基因检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数,验证以PINb-D1b内参基因的检测结果准确性;在nib8的不同区段设计特异性引物来检测转nib8株系拷贝数分析结果是否有差异。最终,建立基于数字PCR技术的高通量检测小麦目标基因拷贝数的分析方法。【结果】 通过试验最终确定了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系。试验确定引物和探针的最佳终浓度分别为500和250 nmol·L-1,确定体系反应最佳退火温度为59℃,最佳DNA模板量为40 ng。以PINb-D1b作为内参基因检测转nib8小麦中nib8的拷贝数,拷贝数检测结果显示第12、16、17、23、29、30株系中nib8拷贝数分别为7个、1个、1个、1个、1个、7个;同时通过比较发现此结果与Real-time PCR以及Southern blot结果一致;在转基因株系中,以PINb-D1b为内参基因,对Wx012和SSII 2个基因进行拷贝数进行分析,同时发现采用这3种内参基因分析转nib8小麦中nib8基因拷贝数的结果一致,说明这3个内参基因都适合用于数字PCR方法;在nib8上游、中游和下游不同区段的设计引物分析拷贝数检测结果一致。【结论】 优化了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数分析方法和反应体系,确立了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系,数字PCR分析结果稳定、可靠,检测通量明显提高,具有一定的应用前景。 相似文献
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佛手瓜又称合掌瓜,德化县俗称掌瓜,原产于墨西哥和中美洲,1915年传入中国,是一种营养丰富、产量高、适应性强且耐储运的蔬菜。1947年赤水街居民从外地引进试种,在德化县已有68年的栽培历史。德化县海拔高,山清水秀,云雾多,气候温和,空气清新生态环境好,地域广阔,非常适合佛手瓜栽培。全县18个乡镇都广泛种植,主要产区在赤水镇赤水街、福全村、吉岭村、小铭村、锦洋村,上涌镇西溪村,盖德镇凤山村,汤头乡吉山村等地。 相似文献
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患者,男,40岁.在“脑囊肿”分流术后3年,因头痛、左侧肢体无力半年于1989年2月入院.病人3年前曾因头痛、左侧肢体无力,CT检查见右额顶颞区广泛低密度改变,初步诊断为“右侧额预颞区巨大脑囊肿”行脑囊肿腹腔分流术。术后症状缓解,能正常参加劳动。近半年来,再次出现头痛和左侧肢体无力而入院。体查:神清,双侧视乳头明显水肿,左侧肢体肌力3~4度,CT复查见原右额顶颞低密度区增大.于低密度区直接穿刺碘水造影,示病变区与脑室不相通.全麻下行右额顶颞开颅探查术,术中见有额顶颞区有一肿物,约7cm×7cm×5cm,边界清楚,包膜完整,内含豆腐渣样内容物;并发现原引流管置于脑室内。全部 相似文献
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蔬菜品种繁多,有些种子由于休眠性强,或果壳果皮坚硬,或有黏液等原因致使发芽迟缓,在做发芽率测定时发芽困难,通过改变种子发芽温度、光照,以及种子去壳等外部条件,能够快速鉴定发芽率高低,及时为生产和经营提供科学决策。 相似文献
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