碱蓬根际和内生细菌菌株对盐碱胁迫下苜蓿生长的影响

为研究碱蓬根际和内生细菌菌株对盐碱胁迫下苜蓿幼苗生长的影响,试验以龙牧801紫花苜蓿为供试品种,将前期从碱蓬根内（JG1）、根际土壤（JT4）和茎内（JJ5）筛选出的具有较强耐盐碱胁迫能力的根际及内生细菌菌株接种于苜蓿幼苗根部。接菌1周后将中性盐（NaCl、Na₂SO₄）和碱性盐（NaHCO₃、Na₂CO₃）按NaCl∶Na₂SO₄∶NaHCO₃∶Na₂CO₃=9∶1∶1∶9混合,并设置0、100、150、200 mmol·L^-1盐碱浓度溶液浇灌苜蓿幼苗根部,进行盐碱胁迫处理。分析盐碱胁迫下碱蓬根际及内生细菌菌株对苜蓿生长及生理的影响,并通过隶属函数和主成分分析综合评价碱蓬根际和内生细菌菌株对盐碱胁迫下苜蓿生长的影响。结果表明：3株促生细菌均能缓解盐碱胁迫对紫花苜蓿生长的抑制作用,促进紫花苜蓿生长,不同促生细菌对盐碱胁迫下苜蓿促生效果为JT4>JG1>JJ5。     

紫花苜蓿根瘤菌分子分型和生物型划分研究

根据表型和共生效应,对种内根瘤菌划分生物型,为苜蓿与根瘤菌高效共生育种提供理论依据。以分离自甘肃省3个栽培区域5个苜蓿品种植株不同部位的根瘤菌株为材料,进行16SrRNA测序、多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)、表型数值分类和共生效应测定。结果表明,78株初筛菌经16SrRNA和MLST分析有20株属于Rhizobium radiobacter;表型特征数值分类将其聚为7个群。接种5个苜蓿品种,选择对共生效率贡献率最大的地上干重进行多重比较。当接种处理地上干重显著高于未接种处理CK时标记共生效应为A,与CK差异不显著时标记为B,显著低于CK时标记为C。以苜蓿品种为甘农3号、甘农9号、陇中、清水和WL168HQ的顺序,将各菌株共生效应结合,形成6种共生模式。结合表型和共生模式,20株R.radiobacter被划分为14种生物型,WL168HQ、甘农3号和陇中苜蓿品种内生物型多样性丰富,甘农9号和清水苜蓿品种内生物型单一。综上所述,根据表型特征和共生模型可以进行种内根瘤菌株的生物型划分,苜蓿品种内根瘤菌生物型多样性丰富。     

硼对根瘤菌在紫花苜蓿体内运移和定殖及对幼苗生长的影响

通过向青色荧光蛋白(CFP)标记的两种根瘤菌菌液Ensifer meliloti LZgn5f (gn5f) 和Ensifer meliloti 12531f (12531f)内添加不同浓度硼并接种于苜蓿幼苗根部,研究硼对荧光标记根瘤菌在甘农5号紫花苜蓿幼苗体内运移和定殖的动态变化及接种对苜蓿幼苗生长的影响。结果表明,添加1 mg/L硼较利于12531f生长, 100 mg/L硼较利于gn5f生长。添加适宜浓度硼对苜蓿幼苗体内荧光标记根瘤菌运移和定殖具有促进作用,两种荧光标记根瘤菌在根部定殖数量较多,其中添加100 mg/L硼15 d时根部12531f数量最高,达2184.99 cfu/g,添加0.5 mg/L硼60 d时gn5f数量最高,达58307.11 cfu/g;同时可向地上运移,主要运移并定殖于下部茎叶内,1 mg/L硼利于12531f在下部茎叶内定殖,100 mg/L硼利于gn5f在下部茎内定殖。对照各部位未检测到两种荧光标记根瘤菌。添加硼处理的单株结瘤数、单株根瘤重、单株叶片数、株高、根长、地上鲜重、地上干重、根鲜重和根干重均高出对照和单独接菌处理,1 mg/L硼+12531f处理高出对照和单独接菌处理,范围在21.31%~909.28%之间;100 mg/L硼+gn5f处理高出对照和单独接菌处理,范围在15.07%~1424.24%之间;虽然单独接种12531f抑制了叶绿素的形成,但添加1 mg/L硼后其含量则升高,分别显著高出对照和单独接菌处理18.31%和36.86%(P<0.05),而接种gn5f则促进了叶绿素的合成,添加100 mg/L硼后含量分别显著高出对照和单独接种处理24.41%和12.92%(P<0.05)。因此,1 mg/L硼与12531f混合接种,100 mg/L硼与gn5f混合接种对根瘤菌在苜蓿幼苗体内运移和定殖及对幼苗的生长具有促进作用,为苜蓿种植提供了依据。     

赤霉素对根瘤菌运移、定殖及苜蓿幼苗生长的影响

【目的】研究赤霉素对荧光标记根瘤菌运移和定殖的动态及接种对甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa L.Gannong No.5)幼苗生长的影响,为增强根瘤菌向苜蓿体内尤其向繁殖器官转移并定殖的能力,促进苜蓿种植业发展提供理论依据和技术支持。【方法】分别向Ensifer meliloti LZgn5f(gn5f)和Ensifer meliloti 12531f(12531f)两种根瘤菌液内添加0.5、1、10和100 mg·L~(-1)赤霉素,测定第1、3、5、7和9天两种根瘤菌OD600吸光度值,同时将添加不同赤霉素的菌液分别浇灌于幼苗根部,于接种后第15、30、45和60天检测根瘤菌在根和地上各组织内运移和定殖及对苜蓿幼苗生长的情况。【结果】添加10 mg·L~(-1)赤霉素稍可促进12531f生长,但效果并不明显;而1 mg·L~(-1)赤霉素对gn5f生长初期效果较好,但随着时间的延长则无明显作用。10 mg·L~(-1)赤霉素促进12531f运移并定殖到下部茎、上部茎和上部叶内,1 mg·L~(-1)赤霉素促进gn5f运移并定殖到下部茎和下部叶内,以无菌水为对照的各组织内未检测到两种荧光标记根瘤菌。单独接种12531f和gn5f,均促进了叶绿素的形成,而添加赤霉素后接种均抑制了叶绿素的形成,但12531f添加10 mg·L~(-1)赤霉素、gn5f添加1 mg·L~(-1)赤霉素接种可使幼苗单株结瘤数、单株根瘤重、单株叶片数、株高、根长、地上干重和根干重则均达最高。其中12531f添加10 mg·L~(-1)赤霉素接种后苜蓿单株结瘤数分别高出对照和单独接菌处理75.71%和11.82%,但差异不显著(P0.05);单株根瘤重分别高出对照和单独接菌处理1 136.11%和55.05%,差异显著(P0.05);单株叶片数分别高出对照和单独接菌处理113.94%和78.28%,差异显著(P0.05);株高分别高出对照和单独接菌处理83.33%和50.24%,差异显著(P0.05);根长分别高出对照和单独接菌处理115.28%和29.17%,差异显著(P0.05);地上干重分别高出对照和单独接菌处理214.27%和206.43%,差异显著(P0.05);根干重分别高出对照和单独接菌处理1 156.19%和1 049.53%,差异显著(P0.05)。gn5f添加1 mg·L~(-1)赤霉素接种后苜蓿单株结瘤数分别高出对照和单独接菌处理82.86%和4.07%,但差异不显著(P0.05);单株根瘤重分别高出对照和单独接菌处理697.22%和105.00%,差异显著(P0.05);单株叶片数分别高出对照和单独接菌处理32.12%和19.13%,株高分别高出对照和单独接菌处理95.24%和37.82%,根长分别高出对照和单独接菌处理76.39%和5.83%,但各处理间均无显著差异(P0.05);地上干重分别高出对照和单独接菌处理125.98%和121.80%,差异显著(P0.05);根干重分别高出对照和单独接菌处理864.43%和762.21%,差异显著(P0.05)。【结论】分别添加10 mg·L~(-1)和1 mg·L~(-1)赤霉素后利于12531f和gn5f在苜蓿体内的运移和定殖并对结瘤、叶片生长、株高、根长、生物量均有促进作用,表明适宜赤霉素浓度可作为促进目标根瘤菌运移和定殖的方法,进而促进植株生长。     

3株紫花苜蓿内生根瘤菌功能差异性分析

以3株紫花苜蓿(Medicago sativa)内生根瘤菌株(LP3、WLP2和WLG1)为材料,进行抗逆和促生能力研究,并采用试管砂培法对WL168HQ苜蓿(M.sativacv.WL168HQ)进行接种试验,以不含根瘤菌的培养液为对照,分析菌株的共生固氮能力。结果表明,菌株WLP2能耐受除红霉素和庆大霉素外的所有抗生素≥300μg·mL~(-1);能在6%NaCl、pH 5~11和温度8~40℃的环境下生长,对盐、pH和温度的适应范围广;能溶解有机磷和无机磷,分泌IAA能力强。菌株WLG1接种,单株结瘤数、地上干重和地下干重显著高于对照处理(P0.05),分别比对照增加了208.16%、72.35%和122.33%;单株有效根瘤重、根长和单株叶片数明显高于对照处理,分别比对照高了6.68%、9.57%和53.59%。综上所述,菌株WLP2对抗生素、盐、pH和温度的抗性以及促生能力较强,菌株WLG1对WL168HQ苜蓿接种效果最佳,共生固氮能力强。     

贮藏方法对紫花苜蓿种子内生根瘤菌定殖的影响

为探索贮藏方法对紫花苜蓿种子内生根瘤菌定殖的影响,将甘农5号紫花苜蓿在结荚期用3种根部接种方法(主根微破损浇灌、根部浇灌、添加苦参碱浇灌)接种两种荧光标记根瘤菌Ensifer meliloti LZgn5f(gn5f)和Ensifer meliloti 12531f(12531f),同时根部浇灌无菌蒸馏水获得的种子,采用信封、信封+布袋、铝箔3种包装材料,分别在25℃、25℃硅胶干燥、-4℃和4℃条件下贮藏6个月后,检测种子内根瘤菌的定殖数量。结果表明:主根微破损接种gn5f获得的种子在-4℃以信封包装贮藏时内生根瘤菌的定殖数量(25.54cfu/粒)显著高于信封+布袋和铝箔的两种包装材料(P0.05),主根微破损接种12531f获得的种子在-4℃以铝箔包装贮藏时内生根瘤菌的定殖数量最高(14.98cfu/粒),但与另外两种包装材料无显著差异(P0.05)。根部浇灌接种gn5f和12531f获得的种子,在25℃干燥贮藏,分别以信封(22.08cfu/粒)和信封+布袋(40.84cfu/粒)包装时内生根瘤菌的定殖数量显著高于其贮藏条件(P0.05),添加苦参碱根部浇灌接种gn5f和12531f获得的种子以铝箔为包装材料,分别在-4℃(25.00cfu/粒)和25℃硅胶干燥(18.08cfu/粒)温度下贮藏种子内生根瘤菌的定殖数量最多,显著高于其他贮藏条件(P0.05)。接种相同目标根瘤菌获得的种子以25℃硅胶干燥和-4℃贮藏时内根瘤菌数量高于25℃和4℃。     

苜蓿根瘤菌cfp荧光标记株的构建及筛选方法

荧光标记根瘤菌在研究根瘤菌侵染宿主形成结瘤时具有良好的示踪效果。本研究以辅助菌株Escherichia coli pRK2073,受体菌苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 12531和苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti GN5,及cfp青色荧光基因供体菌E.coli pMP45179为供试菌株,以三亲本杂交法进行结合转导,并以无氮培养基和TY培养基对标记菌株进行荧光表达及固氮特性的遗传稳定性检测,再对初选菌株以甘农5号紫花苜蓿为宿主进行回接验证,测定了回接植株的生物量,结瘤数和标记菌的占瘤率等指标。结果表明,1)三亲本杂交转导法适用于苜蓿根瘤菌cfp标记菌株的构建,获得大量S.meliloti 12531和R.meliloti GN5的荧光标记株;2)经逐层筛选获得的荧光标记菌中,S.meliloti 12531-cfp6和R.meliloti GNf-cfp5遗传稳定性好,荧光表达量高,结瘤促生能力强;3)与现有抗生素平板分离筛选相比,无氮培养基结合耐药平板筛选能显著提高荧光标记根瘤菌株的甄别筛选效率;4)三亲本杂交法获得的苜蓿根瘤菌荧光标记株个体间差异较大,对标记株固氮及荧光表达能力遗传稳定性的验证和对宿主植物的结瘤促生能力的检测是cfp荧光标记根瘤菌筛选的必要手段。     

接种荧光标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长的影响

将含有cfp(cyan fluorescent protein)基因质粒的荧光标记根瘤菌S.LZgn5-cfp6、S.LZgn5-cfp16、S.LZgn5-cfp28,S.12531-cfp2、S.12531-cfp13、S.12531-cfp26、S.LH3436-cfp1、S.LH3436-cfp2、S.LH3436-cfp6接种于甘农5号紫花苜蓿,测定苜蓿幼苗生物量、单株结瘤数、固氮酶活性等,结果表明:荧光标记根瘤菌可有效促进植株生长和生物量的积累,有明显促生效果;与出发菌相比,荧光标记根瘤菌未对苜蓿幼苗产生显著的不良影响,能在植物体内稳定表达,具有与出发菌株相近的促生能力。     

黑龙江西部垦区农牧场草地生态现状调查

为了解黑龙江西部垦区农牧场草地生态现状,笔者采用实地踏查结合随机样方调查法,于2018年8月份在黑龙江西部垦区设置11个农牧场调查样地,记录各样地草群高度、草群盖度、草产量、物种数量、毒害草数量及人工培育措施等。结果表明:草群盖度大于80%的样地有5个,其中和平牧场草群盖度最大(为88.18%),安达畜牧场草群盖度最小(约为53.00%);干草产量达到3 000 kg/hm~2以上的样地有4个,其中巨浪畜牧场草原生产力最高(鲜草产量为12 408.33 kg/hm~2,干草产量为4 349.07 kg/hm~2),大山种羊场草原生产力最低(鲜草产量为1 780.69 kg/hm~2,干草产量为703.69 kg/hm~2);11个农牧场草类多样性丰富,优质牧草禾本科、菊科和豆科植物数量较多,分别为20种、17种、9种,各占总科数的27.78%、23.61%和12.50%;仅在绿色草原牧场和大山种羊场发现少量毒害草,其余样地均未发现毒害草,表明这几个农牧场保护较好;人工培育措施主要为禁牧休牧、围栏封育和补播等。说明垦区农牧场草地草群生长状况良好,生产力较高,物种组成丰富,优良牧草资源多,草原生态建设较好。     

苜蓿耐药根瘤菌筛选及荧光蛋白标记对根瘤菌耐药性的影响

为明确荧光蛋白标记技术对根瘤菌耐药性的影响,采集6个品种的苜蓿根瘤进行根瘤菌的分离、纯化和初步鉴定,并筛选其中对3种稀土盐抑菌剂La（NO3）3·6H2O,LaCl3和Ce（NO3）3·6H2O以及2种植物源抑菌剂苦参碱和除虫菊素具有耐受性的菌株,得到一株编号为LH3436的根瘤菌,对0.6mg/mL苦参碱具有天然耐受性。将LH3436和对照根瘤菌R.12531以及参比根瘤菌R.GN5进行荧光蛋白标记后,观察其对抑菌剂耐受性的变化。发现各初筛菌株在无氮培养基上的生长状况对非根瘤菌的筛除率最高,所有初筛菌株均为革兰氏染色阴性的快生型产酸菌,全部难以利用柠檬酸盐,而可以利用蔗糖和可溶性淀粉,但对乳糖、葡萄糖和果糖等碳源的利用存在差异性;试验初筛菌株对植物源类抑菌剂的相对耐受性好,而对稀土盐类抑菌剂的相对耐受性差,将筛选根瘤菌进行荧光蛋白标记后,其对抑菌剂的耐受性未发生改变。