柱花草炭疽病菌T-DNA 插入突变体库的构建与分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的柱花草炭疽病是热带牧草柱花草的主要病害,利用根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT)的T-DNA插入突变技术,可使炭疽病菌基因组上被插入部位的基因丧失功能,是研究柱花草炭疽病菌致病机理的重要方法.在先前优化根癌农杆菌介导柱花草炭疽病菌遗传转化体系的基础上,构建了4 616个转化子的突变体库,从中随机选取部分突变体,对其T-DNA插入拷贝数、遗传稳定性、生长速度、产孢量、分生孢子萌发等进行分析.结果表明,所得转化子多为单拷贝,能稳定遗传.一些转化子的生长速度、产孢量、分生孢子萌发率与野生型相比有明显差异.     

根癌农杆菌介导柱花草炭疽菌遗传转化体系的优化

选取含有氯嘧磺隆抗性标记的ILV1基因和报告基因GFP二元载体的农杆菌AGL-1,采用单因子和双因子方法研究根癌农杆菌AGL-1介导柱花草炭疽菌CH008转化过程中各主要因素对转化率的影响,优化构建ATMT转化柱花草胶孢炭疽菌体系条件,使转化效率达到300 ～400个转化子/106个炭疽孢子,即根癌农杆菌AGL-1浓度OD600=0.8,炭疽菌分生孢子浓度为1x106个/mL,AS浓度为100 μmol/L,诱导时间为6h,共培养温度和时间分别为25 ℃和4d.经PCR检测都有GFP片段,并能够表达绿色荧光蛋白.这为进一步开展炭疽菌对柱花草的致病机理研究提供了依据,优化转化体系有利于后续突变体库的扩大、筛选突变体和致病功能基因的研究.     

柱花草炭疽菌突变体库致病缺陷转化子筛选 及T-DNA插入位点侧翼序列分析

比较了接种病原菌侵染柱花草的几种方法的效果,选定出最佳的初筛和复筛方法,进而对1 230 个转化 子进行筛选,得到致病力缺陷菌23 株,其中致病力减弱的菌株18 株,致病力完全丧失的5 株。利用TAIL-PCR 扩增 致病力丧失突变子t-2430 的T-DNA 插入位点侧翼序列,得到大小为476 bp 的一段序列,BLAST 比对已测序炭疽菌 基因组,发现401nt 和数据库的Contig464的部分序列完全一致,进一步对该段序列的功能进行预测,表明T-DNA 插入 在一预测基因的启动子区域,并且这个预测基因与稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae）的天冬氨酸转氨酶(XP_003719674.1）同 源性为79%。     

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