利用酵母双杂交系统筛选与草莓镶脉病毒P6蛋白互作的森林草莓寄主因子

【目的】草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)是侵染草莓的主要病毒,但其侵染草莓的机制尚不清楚。论文以SVBV的P6蛋白为诱饵筛选森林草莓(Fragaria vesca)c DNA文库的寄主因子,为解析SVBV侵染草莓的分子机制提供理论依据。【方法】SVBV接种森林草莓,提取出现明显症状叶片的总RNA,Dnase I处理后,用SMART法反转录合成ds c DNA,均一化处理c DNA并酶切纯化,将400 bp的短片段去除,其余片段连接到p GAD-T7质粒载体上,构建森林草莓初级c DNA文库。同时将SVBV P6构建到酵母双杂交诱饵载体p GBK-T7上,再将p GBK-P6和p GBK-T7分别转化酵母菌株AH109,阳性酵母菌株接种SD/-Trp液体培养基,鉴定诱饵载体对酵母细胞的毒性。将转化p GBK-P6的酵母菌分别涂布SD/-Trp、SD/-Leu-Trp和SD/-His-Trp平板,测定菌落生长情况,分析P6蛋白对酵母报告基因的自激活活性。然后用森林草莓初级c DNA文库质粒转化含有诱饵载体p GBK-P6的AH109酵母菌株,共转化子依次涂布SD/-Leu-Trp、SD/-Leu-Trp-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal平板,最终筛选蓝色且长势较好的阳性菌落,提取酵母质粒并测序,Gen Bank中初步比对候选基因,利用Uniprot在线网站的gene ontology(GO)通路注释互作蛋白因子,分析互作蛋白的生物学功能。【结果】3种c DNA文库平均库容超过2.0×106 cfu,平均文库重组率为97%,文库插入片段平均扩增长度1 kb,表明森林草莓c DNA文库符合试验标准。最终利用SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal培养基筛选得到230个酵母阳性克隆,经过序列相似性比对,除去重复序列、载体序列和移码序列,共筛得15个与SVBV P6互作的寄主因子。GO通路注释结果表明这些寄主因子参与了13种生物过程,包括泛素化、转录因子调节、防御反应、代谢过程、氧化还原和胞内氨基酸代谢等过程;这15个寄主因子的分子功能多样,包括乙酰转移酶活性、萜烯合酶活性、脱氢酶活性、金属离子结合活性、蛋白激酶活性和水解酶活性等。【结论】成功构建了森林草莓酵母c DNA文库,筛选出15个与SVBV P6互作的森林草莓寄主因子,为进一步探明SVBV与森林草莓互作的分子机理提供了理论依据。     

森林草莓转录因子MYB 12基因克隆及蛋白特性分析

采集森林草莓(Fragaria vesca)植株叶片,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物RT-PCR扩增转录因子MYB 12基因,获得1条约1 kb大小的特异性片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段序列全长988 nts,含有完整的MYB 12基因开放阅读框(ORF),ORF长度为855 nts,编码285个氨基酸。序列比对发现,森林草莓MYB 12基因与来源于5种蔷薇科植物MYB基因的序列相似性较高,为75%~76%,而与其他7种非蔷薇科植物MYB基因的序列相似性相对较低,为47%~68%。构建MYB基因系统关系树,发现森林草莓与其他5种蔷薇科植物的MYB基因聚成一个分支,说明森林草莓与蔷薇科植物亲缘关系较近。生物信息学分析表明,MYB 12蛋白具有一定的亲水性,其N-端有2个MYB结构域,属于R2R3-MYB亚族。MYB 12蛋白二级结构主要以α-螺旋为主,并含有一些不规则的卷曲(Random coil)结构。这为研究该基因在植物生长发育及生理代谢过程中的调控机制奠定了基础。     

低能离子束诱变选育平菇菌株

以低能离子束注入诱变平菇（农平8l号）孢子，培养孢子获得双核异核菌株。随机选育4个菌株，进行出菇试验，结果表明，4个菌株子实体颜色及形态特征都有变化。诱变的菌株生长速度普遍快于对照菌株，诱变的菌株生长势普遍好于对照菌株，诱变后各菌株生长发育比对照都快，其中1号生长最快。出菇结果表明各诱变菌株从营养生长转向生殖生长快，出菇早，1号比对照提前12 d，其中以1号菌株产量最高。