Constitutive Expression of α-galactosidase Mel1 Gene in Pichia pastoris

用PCR方法从酵母(Saccharomyces cerevisiae ) AH109中扩增出α-半乳糖苷酶的Mel1基因，将其克隆至整合型载体pGAPZαA中构建成组成型分泌表达酶产物的重组质粒pGAPZα-Mel1。将线性化的重组质粒pGAPZα-Mel1电击转化至毕赤酵母(Pichia pastoris ) KM71，在含有100 mg/mL zeocin和预先涂布有X-α-gal的YPDS平板上选择蓝色阳性菌落。发酵培养酵母的上清经SDS-PAGE分析，在53 kD处有特异带；经非变性PAGE凝胶电泳，与显色底物的反应，检测到α-半乳糖苷酶活性带。重组菌pGAPZα-Mel1 /KM71摇瓶发酵6 d后，培养液α-半乳糖苷酶粗酶活性为12 U/mL。     

质粒拯救型T-DNA标签质粒的构建

[目的]为了高效率地获得转基因植物的旁邻序列。[方法]以pUC18及pWM101为出发质粒,通过用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切质粒pUC18,得到含大肠杆菌复制起点及氨苄青霉素抗性基因的pUC18大片断,并将这段DNA整合到pWM101的T-DNA之中构建重组质粒。[结果]该质粒利用根癌农杆菌转化植物后,可利用潮霉素筛选转化细胞,拯救质粒则可转化大肠杆菌后,以氨苄青霉素进行筛选。[结论]该研究为以后的用T-DNA标签研究植物功能奠定了基础。     

α-半乳糖苷酶基因Mell在毕赤酵母中的组成型表达

用PCR方法从酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH109中扩增出α-半乳糖苷酶的Mell基因,将其克隆至整合型载体pGAPZαA中构建成组成型分泌表达酶产物的重组质粒pGAPZα-Mell.将线性化的重组质粒pGAPZα-Mell电击转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71,在含有100 mg/mL zeocin和预先涂布有X-α-gal的YPDS平板上选择蓝色阳性菌落.发酵培养酵母的上清经SDS-PAGE分析,在53 kD处有特异带;经非变性PAGE凝胶电泳,与显色底物的反应,检测到α-半乳糖苷酶活性带.重组菌pGAPZα-Mell/KM71摇瓶发酵6 d后,培养液α-半乳糖苷酶粗酶活性为12 U/mL.     

影响辣椒T-DNA标签突变体库构建的转化因素探讨

以辣椒自交系H8124无菌苗子叶和下胚轴为外植体,采用根癌农杆菌侵染转化法,将T-DNA标签导入辣椒,以探讨影响转化效率的主要因素,包括外源植物生长调节剂浓度、农杆菌类型、外植体材料、预培养时间、侵染时间等。结果表明,采用苗龄10-15 d的子叶为外植体,预培养2 d后用农杆菌GV3101侵染5 min,外源植物生长调节剂为5.0mg/L 6-BA,辣椒的T-DNA转化可以获得较高的转化效率。