地衣芽孢杆菌CP-16脂类水解酶的研究

本试验旨在通过异源表达获得地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CP-16的脂类水解酶,并探究其在羽毛降解过程中的作用。试验以地衣芽孢杆菌CP-16基因组DNA为模板,扩增脂类水解酶基因,转化入大肠杆菌中表达,获得重组酶L-4。研究重组酶L-4的适宜p H、p H稳定性、适宜温度、温度稳定性以及有机溶剂和金属离子对其相对活性的影响,同时探究其对角蛋白酶K水解天然羽毛角蛋白的作用。结果显示,获得的脂类水解酶基因大小为747 bp,编码248个氨基酸,在大肠杆菌中成功表达出重组酶L-4,其分子质量约为28.3 ku,酯酶活性为0.42 U/m L,适宜p H为6.5,适宜温度为50℃;在p H 6.5~9.5条件下处理30 min相对活性保持80%以上,在低于50℃温度条件下处理30 min相对活性保持70%以上。二价铁离子(Fe~(2+))、钠离子(Na~+)、锰离子(Mn~(2+))、钙离子(Ca~(2+))对重组酶L-4相对活性具有激发作用,钡离子(Ba~(2+))、锌离子(Zn~(2+))、铜离子(Cu~(2+))、镍离子(Ni~(2+))对重组酶L-4相对活性具有抑制作用。当有机溶剂浓度为30%时,重组酶L-4在二甲基亚砜(DMSO)和甲醇中保存97%和85%的相对活性,在丙酮、乙醇中保存45%以上的相对活性,在异丙醇中保存不到20%的相对活性,而在乙腈中相对活性基本完全丧失。用重组酶L-4预处理天然羽毛底物,可提高角蛋白酶K对底物的水解效率,促进率为4.32%。由此可见,脂类水解酶可降解羽毛表层脂质,可在促进角蛋白酶水解羽毛角蛋白中发挥作用。     

高产纤维分解酶黑曲霉诱变选育与发酵条件优化

本试验旨在研究高产纤维分解酶黑曲霉诱变选育与发酵条件优化。通过对黑曲霉X1诱变选育(紫外、硫酸二乙酯、紫外-硫酸二乙酯复合诱变),获得产纤维分解酶能力强的突变菌黑曲霉,并对其产酶发酵条件和水解秸秆能力进行研究。结果表明,黑曲霉X1经紫外、硫酸二乙酯及紫外-硫酸二乙酯复合诱变,筛选出1株产酶能力高的突变菌黑曲霉X1U4-1;与原菌相比,突变菌滤纸酶活性提高了66.7%,β-葡萄糖苷酶活性提高了22.3%,木聚糖酶活性提高了3.8%,还原糖含量(12 h)提高了6.8%。黑曲霉X1U4-1最适发酵产酶条件为发酵时间72 h,玉米芯∶麸皮=3∶7,接种量1.2 mL,硫酸铵浓度4%;在此条件下,滤纸酶活性达到0.77 U/g,纤维素酶活性达到93.80 U/g,木聚糖酶活性达到9 383.18 U/g。本研究表明,采用紫外-硫酸二乙酯复合诱变可有效改善黑曲霉产酶性能和水解秸秆能力。     

枯草芽孢杆菌WB600角蛋白酶重组菌发酵条件优化

本试验旨在对已构建枯草芽孢杆菌WB600角蛋白酶重组菌WB600-K进行发酵条件优化，获得最佳产酶条件，以期提高重组菌角蛋白酶的产量；同时通过研究不同种类碳源和氮源间的组合优化获得成本低廉的重组菌发酵培养基配方。结果显示，当发酵液D_{600 nm}=1.0时添加0.5%木糖诱导发酵WB600-K分泌表达角蛋白酶酶活最佳（P<0.05）；山梨醇作为碳源可显著提高WB600-K角蛋白酶酶活（P<0.05），但成本较高不宜作为混合碳源来源；不同种类碳源（葡萄糖、玉米粉、糖蜜、甘油）组合添加能显著提高重组菌角蛋白酶酶活（P<0.05）。不同种类氮源（蛋白胨、酵母粉、豆粕粉、尿素）组合添加对于重组菌提高角蛋白酶酶活效果不如单一氮源（蛋白胨）（P<0.05）。在诱导发酵48 h时WB600-K产角蛋白酶酶活最高（P<0.05）。对发酵配方进行正交试验优化，WB600-K在玉米粉5.1 g/L、葡萄糖5.9 g/L、糖蜜5.9 g/L、甘油3.0 g/L、蛋白胨20 g/L、NaCl 10 g/L，发酵液D_{600 nm}=1.0时加0.5%木糖诱导发酵48 h能显著提高角蛋白酶酶活（P<0.05），达到56.9 U/mL，较初始培养条件提高49.74%。综上，在优化发酵条件下进行发酵及不同种类碳源间组合能提高WB600-K角蛋白酶活性，可为角蛋白酶工业化生产提供试验依据。     

我国畜禽饲料资源中微量元素砷含量分布的调查研究

【目的】 研究我国不同地区间各种饲料原料中砷含量分布情况及不同饲料原料中砷含量超标情况,确定砷污染高风险原料为严控饲料砷含量,防止饲料砷超标提供科学依据,更为饲料企业科学制定重金属砷的品控方案提供数据支持。【方法】 利用离子色谱-电感耦合等离子体-质谱联用仪（IC-ICP-MS）对采自全国31个省、直辖市和自治区的40种共4 054个主要畜禽饲料原料中砷含量进行测定。【结果】 这40种饲料原料的平均砷含量范围为5.21—13 292.0 μg·kg^-1之间,而各类饲料原料砷含量分布规律是：矿物质饲料（5 018.6 μg·kg^-1）>动物性蛋白饲料（1 704.8 μg·kg^-1）>秸秆类饲料（1 239.0 μg·kg^-1）>牧草类饲料（500.3 μg·kg^-1）>谷类籽实加工副产品（329.24 μg·kg^-1）>植物性蛋白饲料（72.99 μg·kg^-1）>谷类籽实（38.07 μg·kg^-1）。同时发现,谷物籽实及其副产物与秸秆类饲料的砷分布规律：玉米秸>副产物（玉米蛋白粉、喷浆玉米皮、玉米DDGS）>玉米籽实;小麦秸>副产物（小麦麸、小麦DDGS、次粉）>小麦籽实;稻秸>副产物（米糠、脱脂米糠）>稻谷>碎米,是因为谷物植株在生长过程中对砷的富集能力排序：根>叶>茎>谷壳>米粒。通过比较不同省（区）玉米、小麦和豆粕的砷含量发现,不同省（区）同一种饲料原料的砷含量均存在极显著差异（P<0.01）。根据国家饲料卫生标准,在对40种饲料原料砷含量超标率的统计中发现,谷物籽实类饲料、植物蛋白类饲料及牧草类饲料的砷含量均未超标;而谷物籽实加工副产品中的脱脂米糠砷超标率为2.8%,其他未超标;动物蛋白中鱼粉砷超标率5.3%,其他未超标;秸秆类饲料中稻秸砷超标率27.4%,其他未超标;矿物质饲料中石粉与磷酸氢钙砷含量超标率分别为30.8%和60%,其他未超标。不同饲料的砷含量超标率：磷酸氢钙>石粉>稻秸>鱼粉>脱脂米糠。【结论】 以上结果表明：不同种类和不同地区饲料原料中砷含量差异较大,谷物相关的饲料原料中,秸秆类饲料砷含量最高,谷物加工副产物次之,籽实类最低。反刍动物饲料在选择秸秆类原料时,应重点检测砷的含量。同时,磷酸氢钙、石粉、稻秸、鱼粉和脱脂米糠均存在砷含量超标现象,可视为砷污染高危饲料。因此,在实际生产中,应充分考虑不同地区不同原料中的砷含量,加大高危饲料的检测频率,严控饲料砷含量在国标GB 13078-2017允许的范围内,保障饲料品质安全。     

组合酶水解羽绒加工副产物工艺参数的优化

本研究旨在对来源于地衣芽孢杆菌CP-16的重组角蛋白酶和二硫键还原酶协同酶解羽绒加工副产品最佳工艺条件进行探讨。试验探讨角蛋白酶与二硫键还原酶组合水解羽毛角蛋白的适宜比例，并研究蒸汽压力处理时间、酶解时间、组合酶添加水平和水分含量等单一因素对酶解效率的影响，再利用L9（3⁴）正交试验进一步优化处理工艺条件。结果显示，当角蛋白酶与二硫键还原酶的酶活比例为80：1，角蛋白酶终浓度为90 U/mL时，组合酶酶解羽绒加工副产品效率最佳；经压力处理2 h更有利于提高酶解效率；水解60 h酶解率最高，但与48 h差异不显著（P>0.05）；总反应体系中缓冲液为5.5 mL时酶解效率显著高于对照组（P<0.05），但与4.5 mL组差异不显著（P>0.05）。正交试验优化酶解羽绒加工副产品条件发现，影响组合酶酶解效率的因素由大到小依次为压力处理时间、酶解时间、酶剂量；酶解羽绒加工副产品最适条件为：角蛋白酶与二硫键还原酶活性比例为80：1，121℃高压处理2 h，角蛋白酶终浓度为90 U/mL，50℃酶解48 h，此时1 g羽绒加工副产品产生的上清液可溶性蛋白含量为352.72 mg，比对照组提高640.26%。综上，利用多种处理工艺相结合更有利于提高组合酶水解羽绒加工副产品的效率。本试验结果可为羽绒加工副产品资源开发利用提供理论指导。