猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的亚克隆及原核表达

本研究从河北省保定地区6份疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病猪的肺脏中,通过RT-PCR获得PRRSV GP5蛋白完整的基因片段,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,再设计一对引物从重组载体pMD18-T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-6p-dGP5),转化至E.coli BL21感受态细胞。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的目的蛋白。经Western blot分析表明,该蛋白与PRRS阳性血清具有良好的免疫反应性,为进一步研究PRRS新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

含T细胞表位的猪细小病毒VP2基因核酸疫苗的构建及其在小鼠中的免疫原性分析

为研制猪细小病毒(PPV)主要保护性抗原VP2基因核酸疫苗,本研究将猪圆环病毒(PCV)编码T细胞表位P21多肽的序列连接于PPV VP2基因的5’端克隆于pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA-P21-VP2,并将其经磷酸钙介导转染HEK293T细胞中检测其表达情况。SDS-PAGE和western blot检测表明,P21-VP2重组蛋白获得了有效的表达,其分子量约为67 ku。将pcDNA-P21-VP2肌肉注射BALB/c小鼠后,采用ELISA方法检测其抗体,并采用MTT法检测小鼠免疫后脾脏淋巴细胞的增殖活性。试验结果表明,重组质粒能够有效诱导小鼠产生明显的抗体反应,并且对淋巴细胞的增殖反应有明显促进作用。该实验结果为研制有效的PPV核酸疫苗奠定了基础。     

猪细小病毒结构蛋白VP2与猪圆环病毒多肽P21的串联表达

猪细小病毒与猪圆环病毒的混合感染较为普遍,给养猪业造成了较大的经济损失。从河北省部分地区病猪中分离猪细小病毒,通过PCR技术获得VP2蛋白的编码基因,采用PCR技术对猪圆环病毒的多肽P21基因进行扩增。分别将其连入Simple-T载体中,经酶切、PCR及序列测定法进行鉴定。测序正确后,将VP2基因与多肽P21基因插入到pET-32a(+)载体中构建原核表达载体。将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,并用IPTG诱导,诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot可检测到分子量约为85 ku的目的蛋白,结果显示VP2基因与P21基因可以在大肠杆菌中获联合表达。Western-blot试验证明,该蛋白可以与猪细小病毒免疫血清以及猪圆环病毒免疫血清产生特异性结合反应,具有良好的反应原性。     

鹅细小病毒河北株HBZF07 VP2基因的克隆与遗传变异分析

采用PCR技术,对鹅细小病毒（GPV）河北分离株HBZF07的VP2基因进行了克隆与测序,并与Gen-Bank中收录的GPV DY株、B株、HG5/82株和GD株进行了核苷酸同源性比较,绘制了基因进化树。结果表明：河北分离株HBZF07的VP2基因长1 772 bp,包含完整的VP2开放阅读框（1 764 bp）,编码587个氨基酸。与GenBank中其他毒株的VP2基因核苷酸序列相比,与DY（EF515837）的同源性为90.8%,与B（GPU25749）的同源性为96.5%,与HG5/82（AY506547）的同源性为95.4%,与GD（AY512830）的同源性为95.4%。说明该毒株与其他参考毒株的亲缘关系较为密切,同时亦表明GPV的VP2基因是高度保守的。研究结果可为其他学者研究GPV VP2基因相关特性提供科学依据。