继代培养时间对抗性黑松体胚发生的影响

以继代培养0.5、1.5 a和3.5 a的抗性黑松37#家系胚性愈伤组织为材料,观察不同培养时间胚性细胞的形态和体胚成熟的过程,并对愈伤组织的增殖率、每克愈伤形成的体胚数量及体胚萌发率和植株成活率进行测定。结果表明:在继代培养过程中,胚性胚柄细胞团(ESM)结构逐渐疏松,胚柄细胞呈现缩短、增粗的现象;培养时间对抗性黑松愈伤组织的增殖、分化、体胚萌发及植株成活率均有显著影响。3种不同培养时间愈伤组织的增殖率分别为200.37%、182.47%和111.63%,每克胚性愈伤组织形成成熟体细胞胚分别为77、31、5个,萌发率分别为84.43%、51.10%、11.13%;植株成活率分别为73.00%、50.00%、6.70%,均呈下降趋势;3种愈伤体胚成熟的时间也存在显著差异,继代培养时间越长,体胚分化成熟过程越慢,愈伤组织形成子叶胚的时间最短为46 d,最长为74 d。因此,抗性黑松胚性愈伤组织在继代培养过程中胚性逐步降低,体胚发生和植株再生能力下降,短期培养的胚性愈伤组织(0.5 a)为抗性黑松体胚发生较为理想的初始材料,且愈伤组织继代培养时间不宜超过1.5 a。     

培养基成分对黑松体胚发育成熟的影响

【目的】对日本抗性黑松体细胞胚成熟的影响因子进行研究,探究各因素在体细胞胚发生过程中的作用,为进一步提高体细胞胚发生的质量和数量提供理论依据。【方法】胚性细胞团在固体增殖培养基上继代生长10天,使用灭菌(75%乙醇擦拭、紫外灭菌30 min)的电子天平称量1 g胚性细胞团,采用50 mL无菌量筒(紫外灭菌30 min)量取30 mL培养液中于100 mL的三角瓶中,将1 g胚性细胞团转至100 mL的三角瓶中,手动搅拌至细胞团分散,置于90 r·min^-1摇床上,25℃黑暗培养7～8天。随后,取3 mL沉淀悬浮细胞进行继代增殖,每星期继代增殖一次至胚性细胞全部均匀散落于培养液。将继代4次的胚性细胞充分摇匀,取2 mL(鲜质量约200 mg)胚性悬浮细胞喷洒在不同组分麦芽糖(30、45、60 g·L^-1)、脱落酸(ABA)(0、5、10、20、30、50 mg·L^-1)、聚乙二醇(PEG8000)(0、50、75、100、125、150 g·L^-1)、活性炭(AC)(1、2、3 g·L^-1)、琼脂(琼脂6、8、10、12 g·L^-1,植物凝胶2、2. 5、3、3. 5 g·L^-1)以及麦芽糖、ABA、PEG 3因素的组合固体成熟培养基上。【结果】以#1337为材料的体细胞胚成熟发育过程中,麦芽糖45 g·L^-1,获得的体细胞胚数量显著增多。ABA浓度为5～20 mg·L^-1,体细胞胚数量呈显著上升趋势,ABA为20 mg·L^-1时,获得的体细胞胚最多。125 g·L^-1PEG8000为体胚发生最佳浓度; AC 2 g·L^-1时,胚性细胞形成结构完整、数量较多的成熟体胚;成熟培养基中添加琼脂粉,培养基不能凝固,植物凝胶更适合作为成熟培养基凝固剂。3 g·L^-1植物凝胶为抗性黑松体胚发育成熟的最佳浓度。在设计的9种成熟培养基组合中(胚性细胞#1337、#1537、#1637),胚性细胞产生体细胞胚最多的成熟培养基组合为麦芽糖45 g·L^-1、ABA 10 mg·L^-1、PEG8000 125 g·L^-1。在不同的麦芽糖、ABA和PEG组合中,不同无性系生产体细胞胚数量呈现出不同的变化趋势:胚性细胞系#1337体胚发育成熟的最佳组合为麦芽糖45 g·L^-1+ABA 10 mg·L^-1+PEG 125 g·L^-1;#1537和#1637体胚发育成熟的最佳组合为麦芽糖30 g·L^-1+ABA 10 mg·L^-1+PEG 125 g·L^-1;在3个无性系中PEG的极差最大,对抗性黑松体细胞胚发育成熟的影响最大。【结论】抗性黑松体胚发育成熟过程中,麦芽糖45 g·L^-1、ABA20～30 mg·L^-1、PEG8000 125 g·L^-1、AC 2 g·L^-1和植物凝胶3 g·L^-1对体细胞胚成熟都具有促进作用。30 g·L^-1麦芽糖、10 mg·L^-1ABA、125 g·L^-1PEG为抗性黑松体胚发育成熟的最佳组合。