鲐鱼软骨糖胺聚糖的硫酸软骨素的结构及其与生长因子的相互作用

为了开发具有药用价值的硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)的新资源,从鲐鱼(Pneumatophorus japonicus Houttuyn)软骨蛋白聚糖(proteoglycan,PG)制备了糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG),用酶降解和阴离子交换HPLC法测定了GAG的CS的组成及其含量,用凝胶层析法测定了GAG的分子量,用表面等离子体谐振(surface plasmon resonance,SPR)法测定了其与多效生长因子(PTN)、中期因子(MK)和肝细胞生长因子(HGF)相互作用的动力学参数结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。结果显示,鲐鱼软骨GAG含量约为651μg/mgPG或1.09μmol/mgPG(按照二糖单位计算),主要含CS(1.03μmol/mgPG,按照二糖单位计算),CS酶解产生的主要二糖单位是ΔDi-6S(38.8%)和ΔDi-4S(46.3%),有少量的ΔDi-0S(8.4%)和ΔDi-diSD(6.5%)。GAG(CS)的分子量为78kD。GAG(CS)与生长因子的相互作用的动力学参数ka((mol/L)-1.s-1)、kd(s-1)和KD(nmol/L)分别为(2.77±0.17)×105、(7.74±1.56)×10-5和(0.28±0.06)(MK),(1.05±0.22)×104、(4.16±0.80)×10-3和(417±131.3)(PTN),(7.04±0.94)×105、(7.84±2.82)×10-3和(11.1±3.80)(HGF)。该GAG同MK、HGF和PTN有高的或较高的亲和性,暗示鲐鱼软骨GAG的CS有可能通过调节生长因子的信号转导途径而对某些疾病发挥治疗作用,具有潜在进一步药用开发价值。     

豇豆根瘤亚细胞组分中ASAL的分段盐析

68．5％的腺苷酸琥珀酸裂解酶(ASAL)活性和62．2％的5-氨基-4-咪唑-N-腺苷酸羧基酰胺核糖核苷酸(SAICAR)裂解酶活性分布在豇豆根瘤亚细胞的可溶性组分中。亚细胞可溶性和颗粒组分的ASAL和SAICAR裂解酶活性回收率均在50％-55％(NH4)2SO4饱和度分段盐析沉淀中出现1个峰值。但在颗粒组分提取液的60％-65％(NH4)2SO4饱和度分段盐析沉淀中,分别另有一个小的ASAL和SAICAR裂解酶活性回收率峰值出现。讨论了ASAL是1个双功能酶及其同工酶存在的可能性。     

EXTLI的酶催化受体底物专一性研究

构建了含hEXTLI的p3×FLAG-CMV8表达载体并转染进入COS-7细胞,用蛋白印迹法成功鉴定了表达 酶蛋白.采用同位素标记技术测定GlcNAcT和α-1,4-GalNAcT两种酶活性,分析结果表明:对照、HS和完全去 磺基化的硫酸乙酰肝素(CDSNAc-HS)作为受体底物时的GlcNAcT 活性分别为2×10-2,1.72,3.99pmol/mL培 养介质·h.CDSNAc-HS作为受体的GlcNAcT活性至少为使用HS时的酶活性的1倍.使用HS、CDSNAc-HS、 Chondroitin作为受体,并没有检测到明显的α-1,4-GalNAcT活性.研究显示HS链的硫酸化修饰将抑制EXTLI 的GlcNAcT活性,hEXTLI不能催化GalNAc连接到生长的HS链上.     

几种离子对豇豆根瘤腺苷酸琥珀酸裂解酶活性和最适PH值的影响

在含１５％（ｖ／ｖ）甘油和ｐＨ８．０的１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｃｉｎｅ缓冲液中，当离子浓度＜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ时，Ｋ＋和Ｎａ＋离子是豇豆根瘤腺苷酸琥珀酸裂解酶（ＡＳＡＬ）的激活剂，其最适浓度约为７５ｍｍｏｌ／Ｌ，可分别提高酶活性４０％和３５％。Ｍｇ２＋离子是ＡＳＡＬ的抑制剂，能拮抗Ｋ＋和Ｎａ＋离子的激活效应。ＨＰＯ二４离子可显著降低酶活性，抑制效应与ＨＰＯ二４离子浓度呈正相关。在含１５％（ｖ／ｖ）甘油和ｐＨ６．６～８．０的１００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液中，ＡＳＡＬ的最适ｐＨ值约为７．４，而在含１５％（ｖ／ｖ）甘油和ｐＨ７．４～８．６的Ｔｒｉｃｉｎｅ缓冲液中，ＡＳＡＬ的最适ｐＨ值约为８．２。     

编码日本梨树(Pyrus pyrifolia )花粉类β-1,3-葡聚糖酶蛋白的cDNA克隆与核苷酸序列

构建了日本梨树(Pyrus pyrifolia)花粉cDNA文库,发现了一个编码花粉管分泌的类β-1,3-葡聚糖酶蛋白(BGN-1)的cDNA(bgn-1)并测定了其序列.bgn-1由1408 bp组成,包括47 bp的5'-非翻译区,由1194bp组成并编码了397个氨基酸的ORF和167 bp的3'-非翻译区.3'-非翻译区含有1个NUE(AATTAA)和3个似FUE的基序,分别位于1369～1374(AATTAA)、1320～1325、1327～1332(TTTTTA)和1363～1368(TTTGGA).bgn-1编码的蛋白(BGN-1)与DDBJ中的植物β-1,3-葡聚糖酶的序列相似性范围为37%～59%,与3D结构已知的大麦β-1,3-葡聚糖酶(GⅡ)的序列相似性为39.7%.对GⅡ与BGN-1进行的疏水簇分析(HCA同源分为87.1%,＞75%的一般标准)和使用3D-PSSM软件进行的分析暗示,BGN-1的3D结构与大麦GⅡ同源性最大(≥95%的肯定度).BGN-1的信号肽长度为22 aa,成熟的BGN-1(375 aa)的理论分子量为4 0723 D,理论pI值为9.59,诊断氨基酸残基模式(D,L,S,L)与禾谷类的与生长相关的亚家族D的诊断氨基酸残基模式(D,L,S,Q)极相似.在BGN-1的C-端延伸区的位点352～367之间发现了1个功能不清,重复出现的ProXXPro结构.     

甘油对豇豆根瘤腺苷酸琥珀酸裂解酶活性的影响

】在缓冲液中添加１５％（Ｖ／Ｖ）甘油可使腺苷酸琥珀酸裂解酶（ＡＳＡＬ）的活性提高２４％，对防止ＡＳＡＬ变性失活的效果显著。在４℃静置８，２３和５２ｈ后，ＡＳＡＬ活性分别为原活性的９３％，７４％和６４％，而不加甘油的对照，ＡＳＡＬ活性仅分别为原活性的３０％，３％和０。添加甘油不影响ＡＳＡＬ的最适ｐＨ值     

5—氨基—4—咪唑—N—琥珀酸羧基酰胺核糖核苷酸的合成

5-氯基-4-咪唑-N-琥珀酸羧基酰胺核糖核苷酸(SAICAR)是从头嘌呤合成中的双功能酶腺苷酸琥珀酸裂解酶(EC 4、3、2、2)的底物之一,被成功地用腺苷酸琥珀酸裂解酶合成.从72.00×10~(-?)mmol的5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核糖核苷酸(AICAR)得到43.78×10~(-3)mmol的SAICAR,产率约为AICAR的60.8%.     

豇豆根瘤亚细胞组分中ASAL的分段盐析

68.5%的腺苷酸琥珀酸裂解酶(ASAL)活性和62.2%的5-氨基-4-咪唑-N-腺苷酸羧基酰胺核糖核苷酸(SAICAR)裂解酶活性分布在豇豆根瘤亚细胞的可溶性组分中.亚细胞可溶性和颗粒组分的ASAL和SAICAR裂解酶活性回收率均在50%～55%(NH4)2SO4饱和度分段盐析沉淀中出现1个峰值.但在颗粒组分提取液的60%～65%(NH4)2SO4饱和度分段盐析沉淀中,分别另有一个小的ASAL和SAICAR裂解酶活性回收率峰值出现.讨论了ASAL是1个双功能酶及其同工酶存在的可能性.