利用微卫星DNA分子标记分析中华绒螯蟹养殖群体遗传分化

养殖河蟹苗种来自各繁育场,经过繁育场多年封闭或半封闭繁育后河蟹多样性是否降低?本研究以长江水系天然群体为对照,利用微卫星分子标记分析中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)江苏兴化、安徽宣城、辽宁盘锦养殖群体遗传分化。结果表明,4个群体平均有效等位基因数(Ne)分别为9.03、8.77和6.94、8.71;平均观测杂合度(Ho)为0.70～0.75;平均期望杂合度(He)为0.87～0.90;微卫星位点平均多态信息含量(PIC)介于0.84～0.87之间,呈现高度多态性;长江水系天然群体遗传多样性水平高于养殖群体。遗传分化系数F-统计量(FST)介于0.0123～0.0207(FST<0.05);分子方差分析(AMOVA)显示,大部分遗传变异(为98.64%)存在于个体间,少部分变异(为1.36%)存在于群体间。群体间FST和AMOVA分析说明,4个群体处于低等遗传分化水平,除安徽宣城群体与辽宁盘锦养殖群体间遗传分化不显著(P>0.05),其他群体间遗传分化极显著(P<0.01)。基于DA遗传距离构建NJ聚类发现安徽宣城养殖群体与辽宁盘锦养殖群体聚为一支,江苏兴化养殖群体与长江水系天然群体聚为另一支。结构分析107份参试中华绒螯蟹样本被分为二个种群,江苏兴化养殖群体与长江水系天然群体属同一种群,安徽宣城养殖群体与辽宁盘锦养殖群体为另一种群。研究显示,中华绒螯蟹养殖群体具有较高的遗传多样性水平,遗传分化水平低,具有新品种选育的利用价值。     

日本沼虾养殖群体主要形态性状对体质量的通径分析

从封闭养殖5代的6月龄日本沼虾群体中随机选取200尾雌虾和70尾雄虾,测定体质量以及全长、体长、头胸甲长、头胸甲宽、头胸甲高、腹部长、第二腹节宽和第二腹节高等表型形态性状,采用相关分析、通径分析和回归分析方法,分析表型形态性状对体质量的影响。结果显示:体质量仍具有最大的选择潜力,雌虾的全长、体长、腹部长等性状和体质量的通径系数达到极显著水平,其中体长对体质量的直接影响和决定程度最大;雄虾的全长、头胸甲高和体质量的通径关系达到极显著水平,全长对体质量的直接影响和决定程度略大于头胸甲高;雌、雄虾所选性状对体质量回归方程的回归关系均达到极显著水平,所选性状与体质量的复相关系数分别为0. 933和0. 930,可见这些性状经过5代封闭养殖后,在雌雄虾中仍是影响体质量的主要自变量指标。     

罗氏沼虾 Doublesex 基因的原核表达与蛋白纯化

【目的】Doublesex 属于 DMRT 基因家族成员之一，在控制性别特异性分化中起关键作用。克隆罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）Doublesex 基因（MrDsx）的开放阅读框序列，构建重组质粒并诱导其表达，纯化获取罗氏沼虾重组蛋白 MrDsx，可为后续开展罗氏沼虾 MrDsx 基因的功能研究提供基础数据。【方法】基于罗氏沼虾 MrDsx 的开放阅读框序列，通过特异 PCR 产物与表达载体 pET-32a（+）连接，获得重组质粒 pET-32a-MrDsx，将其转化大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，构建罗氏沼虾 MrDsx 基因的原核表达细胞。利用异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）对阳性转化细胞进行诱导表达，并以 SDS-PAGE 电泳，Western blot 和质谱分析检测诱导表达的重组蛋白。【结果】以罗氏沼虾性腺 cDNA 为模板，利用 MrDsx 基因的特异引物，PCR 扩增获得了约 660 bp 大小的单一 DNA 条带。经测序确认为 MrDsx 基因的 ORF 序列。重组质粒 pET-32a-MrDsx转化后的感受态细胞经 IPTG 在 37 ℃条件下诱导 4 h 后获得罗氏沼虾重组蛋白 MrDsx。当 IPTG 终浓度为 0.1~0.5 mmol/L 时，重组蛋白 MrDsx 的表达量可达到峰值。可溶性分析显示，重组蛋白 MrDsx 主要以包涵体形式表达，经 8 mol/L 尿素溶解、Ni 柱纯化及透析复性后，SDS-PAGE 电泳和 Western blot 检测发现重组蛋白的相对分子量约 55 kD，且条带单一，表明重组蛋白 MrDsx 能被鼠抗 His-tag 单克隆抗体特异性识别。质谱分析结果显示，片段化肽段与理论的氨基酸序列相符，匹配度达到 100%。【结论】成功获得了 MrDsx 基因原核表达的重组质粒pET-32a-MrDsx。诱导表达的重组蛋白经溶解、纯化及复性后，可形成高纯度的活性罗氏沼虾 MrDsx 重组蛋白，为后续开展罗氏沼虾 MrDsx 基因的功能研究、互作蛋白的筛选和性别调控机制的解析提供初步依据。     

日本沼虾微卫星引物筛选及群体遗传多样性分析

采用(CT)15、(CA)15两种生物素标记及磁珠富集法构建了太湖日本沼虾基因组微卫星富集文库。120个微卫星克隆中83个位点的核心序列重复在10个以上,长度介于191～580bp,平均为311bp;重复类型中,(CA/GT)n及(AG/TC)n分别占59.09%及20.45%,还检测到(GC)n、(AAG)n、(ACAA)n和(GGCAGA)n等17种类型,包括25.75%完美型、20.45%非完美型和53.80%复合性。用其中12条微卫星引物扩增吴江、滨湖、宜兴和吴兴4个群体240个个体的基因组DNA,各位点表现出较高的遗传多样性,除Mni86、Mni103和Mni114外,其它群体位点大都表现出显著的杂合子缺失,4个群体的遗传分化为低度分化(FST<0.05),4个群体中97.58%遗传变异存在于群体内,仅有2.42%的遗传变异来自于群体之间;吴江和吴兴群体亲缘关系最近,与宜兴和滨湖群体亲缘关系渐远。