纽荷尔脐橙CRTISO基因片段的克隆与分析

利用RT-PCR技术,从纽荷尔脐橙(Citrus sinensisOsbeck)果实cDNA中分离出类胡萝卜素异构酶(Carotenoid isomerase,CRTISO)基因片段。该片断长446 bp,编码148个氨基酸。用BLAST比较其氨基酸同源性发现,该片段氨基酸残基与伏令夏橙(C.sinensisOsbeck)、番茄(Lycopersicon esculentumMiller)和拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)CRTISO的同源性分别为99%、85%和83%,与里斯本柠檬(C.limonBurm.F.)和温州蜜柑(C.unshiuMarc.)完全一致。半定量RT-PCR分析表明,CRTISO基因在8~11月份纽荷尔果实中均有表达,10月份的表达量最大。     

三种豆科植物总DNA提取方法的比较

以菜豆、蚕豆、黄豆的幼嫩叶片及其种子为材料,采用高盐低pH值法、SDS法和改良CTAB法3种不同的DNA提取方法提取其总DNA,用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。分析比较各种方法的提取效率,从中找出最适的DNA提取方法。结果表明,对于大豆、蚕豆、黄豆的幼嫩叶片,无论从得率上还是质量上看,高盐低pH值法均明显优于其它两种方法。     

红肉脐橙番茄红素β-环化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的功能表达

以'红肉脐橙'（Citrus sinensis Osbeck 'Cara Cara'）果实中分离的mRNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.6 kb的番茄红素 β-环化酶（lycopene β-cyclase,Lcyb）cDNA片段。序列分析表明,该cDNA长1654 bp,包含两个转录本Lcyb1和Lcyb2,最大开放读码框均为1512 bp,可编码504个氨基酸。通过PCR方法获得红肉脐橙Lcyb1和Lcyb2 cDNA编码区全长,构建了Lcyb1和Lcyb2的原核表达载体pET-CitLcyb1和pET-CitLcyb2,并通过颜色互补试验证实表达的融合蛋白6×His-Lcyb1和6×His-Lcyb2均可将番茄红素转化为β-胡萝卜素。     

一种适合于成熟脐橙果皮和果肉的RNA提取方法

研究了一种适合脐橙果实成熟过程中有效的RNA提取方法。结果表明利用该方法从不同成熟时期果实的果皮和果肉中提取的RNA可以有效用于RT-PC,cDNA-AFLP和RNA杂交。其A260/A230的比值超过2.0,A260/A280的比值在1.65-1.92的范围之间。另外该方法也证明可以广泛用于柑橘叶片,未成熟的幼果,枳壳幼苗和柑橘愈伤组织的RNA提取,是一种安全、方便和适用性较广的RNA提取方法。     

红肉脐橙番茄红素β-环化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的功能表达

以'红肉脐橙'(Citrus sinensis Osbeck'Cara Cara')果实中分离的mRNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.6 kb的番茄红素β-环化酶(lycopene β-cyclase,Leyb)cDNA片段.序列分析表明,该cDNA长1 654 bp,包含两个转录本Lcyb1和Lcyb2,最大开放读码框均为1 512 bp,可编码504个氨基酸.通过PCR方法获得红肉脐橙Lcyb1和Lcyb2 cDNA编码区全长,构建了Lcyb1和Lcyb2的原核表达载体pET-CitL-cyb1和pET-CitLcyb2,并通过颜色互补试验证实表达的融合蛋白6×His-Lcyb1和6×His-Lcyb2均可将番茄红素转化为β-胡萝卜素.     

植物精油与环糊精包合物的制备及对柑橘绿霉病的抑制作用

指状青霉（Penicillium digitatum）侵染引起的绿霉病是柑橘采后最具破坏性的病害之一。化学杀菌剂（如咪鲜胺等）能有效抑制该病害的发生,但容易诱导致病菌产生耐药性,且带来环境污染和食品安全问题。前人研究表明,植物精油及其活性组分能显著降低柑橘采后病害且不影响果实品质,是一种潜在的生物杀菌剂,但存在易挥发和氧化等问题,限制了其实际应用。将植物精油与环糊精包合能有效克服上述缺陷,提高植物精油的应用效果。为了提升植物精油组分反式-2-己烯醛对柑橘绿霉病菌的控制效果,本研究拟采用饱和水溶液法制备反式-2-己烯醛与α-环糊精（α-CD）、β-环糊精（β-CD）、γ-环糊精（γ-CD）和羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）包合物,并考察包合物对指状青霉的离体和活体控制效果,在此基础上解析效果最优包合物的结构特点和包合模式。结果显示,通过饱和水溶液法成功制备了反式-2-己烯醛与α-CD、β-CD、γ-CD和HP-β-CD的四种包合物,分别命名为α-CDTH、β-CDTH、γ-CDTH和HP-β-CDTH。外观形态结果显示,α-CDTH、β-CDTH和γ-CDTH粉末细腻绵密,HP-β-CDTH粉末粗糙,颗粒分明。四种环糊精包合物均能有效抑制P.digitatum菌丝体的生长且具有浓度依赖性,β-CDTH和γ-CDTH抑制P.digitatum菌丝体生长的最小杀菌浓度（Minimum Fugicide Concentration,MFC）为1.00 mg/mL,而α-CDTH和HP-β-CDTH抑制菌丝体生长的MFC分别为2.00和4.00 mg/mL。包合率结果显示,γ-CDTH包合率最高,为75.36%,HP-β-CDTH包合率最低,仅为38.63 %。相溶解度结果表明,四种环糊精包合物的相溶解度曲线类型为AL型,溶解性大小依次为HP-β-CD>γ-CD>β-CD>α-CD。综合离体抑菌效果、包合率和溶解性可知,γ-CDTH综合表现最佳,选择其开展后续实验。活体接种试验结果表明,不同浓度 γ-CDTH处理能不同程度降低柑橘果实绿霉病发病率（P<0.05）,以8.00 g/L γ-CDTH处理效果最佳;贮藏6 d时,对照果实全部腐烂,8.00 g/L γ-CDTH处理组果实发病率仅为58.3%,效果与咪鲜胺相当（56.7%）。此外,γ-CDTH处理能有效维持柑橘果实硬度,且对柑橘果实失重率、色泽、维生素C（Vc）含量、可溶性固形物无不良影响。扫描电镜（Scanning Electron Microscopy,SEM）结果表明,γ-CDTH与γ-CD、γ-CD与反式-2-己烯醛物理混合物的形状和大小有明显差异,表现在γ-CD形态大小不一,大部分呈无规则晶体,而物理混合物表面粗糙,γ-CDTH表面光滑,有类似片状的形态。核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance,NMR）分析结果表明,γ-CD的H-3''和H-5''与TH的H-6''之间的氢键相互作用是γ-CDTH的形成基础。综上,本实验制备了反式-2-己烯醛的四种环糊精包合物,且验证了γ-CDTH的抑菌性能和构象特征,研究结果可为γ-CDTH用于降低柑橘采后病害提供直接的依据,也为植物源天然防腐剂开发提供理论基础。     

‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析‘红肉脐橙’（Citrus sinensis Osbeck cv. Cara Cara）八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并进行原核表达。【方法】以‘红肉脐橙’果实中分离的mRNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA片段,并分析其序列;利用PCR技术获得‘红肉脐橙’PSY cDNA的编码区全长,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+),获得重组质粒pET-CitPSY转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】‘红肉脐橙’PSY cDNA长1 520 bp,最大开放读码框为1 308 bp,可编码436个氨基酸,核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在75%和70%以上,并且发现‘红肉脐橙’PSY的N末端存在转运肽信号序列,成熟的PSY包含1个跨膜结构域。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为52 kD。【结论】该研究为进一步开展柑橘果实色泽分子改良奠定了基础。