基于iTRAQ质谱分析技术筛选南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白

为了从蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿(Medicago sativa ‘Millennium’)适应盐胁迫的分子机制,本研究以30 d苗龄的南方型紫花苜蓿实生苗为材料,分析正常培养和250 mmol/L NaCl处理72 h后根中的蛋白表达变化,采用同位素相对标记与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合双向液相色谱与串联质谱(2-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)定量蛋白质组技术鉴定南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白,对所获得差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出可能耐盐潜在靶标蛋白.同时,选择5个差异表达蛋白进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证.结果表明,共鉴定3 857种定量蛋白,534种差异蛋白(变化倍数≥1.2,P＜0.05),其中表达上调的281种,表达下调的253种.基因本体(Gene Ontology,GO)分子功能提示这些差异性蛋白主要参与转运活性、催化活性和酶调控活性.京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路显著性富集于代谢途径、次生代谢产物生物合成、苯丙氨酸代谢和核糖体等(P＜ 0.05,错误发现率(false discovery rate,FDR)＜ 0.05).成功鉴定的差异蛋白分别涉及到信号传递(8.99％)、抗氧化物(7.68％)、防御(5.61％)、蛋白质合成、加工和降解(14.79％)、能量产生与转运(5.81％)、代谢(26.97％)、膜与胞内运输(5.62％)和细胞结构、分裂和细胞骨架(2.06％)等.差异表达蛋白中与信号传递、抗氧化物和防御等相关的蛋白表达量总体上调,而与代谢和能量产生与转运相关蛋白表达量总体下调.qRT-PCR实验发现,mRNA与蛋白质表达水平并不一致.研究发现组氨酸磷酸转移蛋白、丝裂原活化蛋白激酶、h类硫氧还蛋白、蛋氨酸亚砜还原酶基因、鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate, GDP)解离抑制因子、脂质转移蛋白、β-1,2-木糖基转移酶和H2A/H2B/H3/H4核心组蛋白等可能是紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白.本研究采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,有效地筛选出南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白,为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制奠定了坚实的基础.     

南方型紫花苜蓿苗期叶片盐胁迫差异蛋白分析

以南方型紫花苜蓿(Medicago sativa ‘Millennium’)30 d苗龄的实生苗为实验材料,分析正常培养和250 mmol/L NaC1处理72 h后叶片中的蛋白表达变化,以期从蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿适应盐胁迫的分子机制.采用同位素相对标记与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合双向液相色谱与串联质谱(2-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)定量蛋白质组技术鉴定南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫的差异表达蛋白,对所获得差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出可能的耐盐潜在靶标蛋白.结果表明,共鉴定3 712个定量蛋白,417个表达量有显著差异的蛋白质(变化倍数≥1.2,P≤0.05),其中包含291个表达上调的蛋白,126个表达下调的蛋白.按照基因本体(Gene Ontology,GO)分类体系,对差异蛋白归类分析,揭示其亚细胞定位和分子功能.京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路显著性富集于代谢途径、次生代谢产物生物合成、吞噬体、脂肪酸代谢和光合作用等(P＜0.05,错误发现率(false discovery rate,FDR)＜0.05).成功鉴定的差异蛋白分别涉及到光合作用(7％)、信号传递(3％)、防御(2％)、碳水化合物代谢(11％)、氨基酸代谢(7％)、脂类代谢(5％)、其它代谢(7％)、蛋白质合成、加工与降解(18％)、细胞结构、分裂和细胞骨架(3％)、抗氧化物(6％)、能量产生与转运(7％)、膜和胞内运输(7％)及未知功能蛋白类(16％).差异表达蛋白中与抗氧化物、能量产生与转运、防御和信号传递及代谢等相关的蛋白表达量总体上调,而与蛋白质合成、加工与降解和光合途径相关蛋白表达量总体下调.研究发现,细胞色素P450、PSⅡ放氧增强蛋白、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、甘露糖-6-磷酸还原酶、海藻糖-6-磷酸合酶、天冬氨酸转氨酶、E3泛素连接酶和H+-ATP酶C亚基蛋白等可能是紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白.采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,能有效地筛选出南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫差异表达蛋白,这些差异表达蛋白可能在紫花苜蓿耐盐调控过程中发挥重要作用,该研究为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制提供理论依据.     

南方型紫花苜蓿根系盐胁迫应答转录因子鉴定与分析

转录因子可以调节众多下游基因的表达,在植物抗逆境中起重要的调节作用。为了解析转录因子在南方型紫花苜蓿适应盐胁迫环境的分子机制,以南方型紫花苜蓿Medicago sativa Millennium为材料,以正常培养（WT_ck1）和氯化钠（盐）胁迫（WT_N1）条件下的2个样品根系进行转录组分析,鉴定紫花苜蓿根系盐胁迫应答转录因子基因。同时,随机挑选4个转录因子差异表达基因进行实时荧光定量qRT-PCR（3次重复）,验证转录组测序技术（RNA-Seq）结果的可靠性。结果表明:紫花苜蓿根系在250 mmolL－1氯化钠 胁迫下72 h,共检测到31 907个基因表达量发生了改变,表达量差异达到2倍以上的基因共2 758 个。其中,隶属于38个转录因子家族199个转录因子在盐胁迫下差异表达,上调表达104个,下调表达95个。在各转录因子家族中,盐胁迫应答基因数量最多的是MYB基因家族,其后分别是AP2-EREBP,bHLH,WRKY,NAC和GRAS基因家族,这暗示了紫花苜蓿根系对盐胁迫响应可能是多种转录因子家族共同参与的应答过程。 qRT-PCR分析表明:4个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。此外,MsERF-2b,MsbHLH,MsbZIP,MsGRAS,MsNAC,MsMGT-3a和MsWRKY等转录因子被选为与盐胁迫应答相关的候选转录因子。该研究结果为阐明植物对盐胁迫的应答机制提供了新的线索。图3表3参36     

南方型紫花苜蓿叶片盐胁迫应答转录因子鉴定与分析

以南方型紫花苜蓿‘Millennium’为材料,以正常培养（WT_CK2）和250 mmol·L-1 NaCl胁迫下72 h时（WT_N2）条件下的2个样品叶片进行转录组分析,鉴定紫花苜蓿叶片盐胁迫应答转录因子基因。同时随机挑选4个转录因子差异表达基因进行实时荧光定量qRT PCR验证RNA Seq结果的可靠性。紫花苜蓿叶片在250 mmol·L-1 NaCl胁迫下72 h时,检测到表达量差异达到2倍以上的基因共7 497个,其中包括隶属于46个转录家族474个转录因子在盐胁迫下的差异表达,上调242个,下调232个。bHLH,NAC,WRKY和C2H2转录家族成员基因70%以上表达上调。实时荧光定量PCR分析表明4个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。此外,还发现大量紫花苜蓿盐胁迫应答的转录因子候选基因如MsERF110,MsERF071,MsbHLH36,MsZFP,MsHSFB 3,MsMYB,MsNAC和MsWRKY等。同时,也揭示了紫花苜蓿叶片对盐胁迫响应可能是多种转录因子家族共同参与的应答过程。     

南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析

为了从基因和蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿适应盐胁迫环境的分子机制,以南方型紫花苜蓿Millennium为材料,对正常培养和盐胁迫条件下的2个样品叶片进行转录组和蛋白质组关联分析。结果表明,定量蛋白和基因关联系数为0.2485;变化趋势相反差异蛋白和基因表达的关联系数为-0.2440;变化趋势相同差异蛋白质和基因表达的关联系数为0.8122。鉴定出109个与差异基因表达趋势相同的差异蛋白,其中77个上调,32个下调,这些差异蛋白功能涉及光合作用、抗氧化物、信号传递、翻译后修饰、翻译和分子伴侣、胁迫防御、能量产生与转运、代谢和其它未知功能蛋白等。下调表达的蛋白主要与光合作用相关,而上调表达的蛋白主要参与了抗氧化物、信号传递和胁迫防御等。此外,关联发现了与紫花苜蓿盐胁迫响应相关的III类过氧化物酶、铁蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、LRR类受体激酶、ABA反应蛋白、钙联接蛋白2、液泡H+-ATP酶C亚基和NADP-苹果酸酶等差异蛋白。本研究通过高通量多组学数据的关联分析,发现一些可能作为紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白(基因),这为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制奠定了坚实的基础。