苏云金芽胞杆菌XL6 BTXL6_11095基因对生物被膜相关表型的调控

在细菌生物被膜（bacterial biofilm,BBF）状态下，细菌往往具有更强的抗紫外线能力、环境适应性和耐药性。本课题组在前期工作中通过转座子插入突变强生物被膜产生菌苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）XL6，筛选出了一个可能调控生物被膜的基因BTXL6_11095。本文以该基因为研究对象，通过生物信息学手段分析该基因功能，构建了BTXL6_11095基因敲除菌株，并对其生物被膜相关表型进行了分析。生物信息学分析结果表明BTXL6_11095基因的结构域为PAS-GGDEF-GGDEF-EAL。生物被膜相关表型分析表明，与野生菌株相比，基因敲除菌株的生长曲线基本不变，群游能力上升，生物被膜形成能力减弱、UV-B抗性降低。本研究通过对BTXL6_11095基因表型变化综合评估，从功能角度揭示此基因对Bt XL6生物被膜相关表型的影响，为进一步解析Bt XL6生物被膜调控网络和构建高抗UV的工程生物被膜奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌XL6~-候选生物被膜调控基因00940序列分析及基因敲除突变体构建

细菌生物被膜(bacterial biofilm,BBF)可以提高细菌的紫外线抗逆性,调控细菌对环境胁迫的适应能力。本研究以课题组前期比较基因组工作中筛选出的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)XL6-(Gen Bank No.CP013000.1)的调控生物被膜形成的候选基因00940为基础,分析其基因功能,并构建基因敲除突变株。通过生物信息学分析发现00940基因可能编码谷氨酰胺合成酶,并受到转录因子Sig L、CcpA、Deg U和Lex A的调控。在枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中,Sig L是一种增强子,位于枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶基因的下游,负责转录编码谷氨酸脱氢酶的roc G基因;CcpA转录因子参与代谢产物的分解;Deg U控制鞭毛形成和生物被膜形成的基因表达;Lex A蛋白在DNA损伤的情况下被诱导,是细菌SOS DNA修复系统的转录抑制因子,推测这些转录因子在Bt中也发挥相似的作用。通过PCR获得00940基因上、下游同源臂和卡那霉素(kan)抗性基因,利用重叠PCR获得完整的基因敲除片段。根据酶切位点将基因敲除片段和p MAD温敏载体进行重组反应,得到重组质粒。将重组质粒电击转化Bt XL6-,筛选获得了00940基因敲除突变株。以Bt Xl6-作为对照,对Bt Xl6-00940基因突变株进行表型分析,包括生长曲线测定、群游能力测定以及生物被膜形成能力测定。结果表明,00940基因的敲除对菌株的生长趋势没有影响,但是群游能力和生物被膜形成能力提高,初步确定00940基因的敲除提高Bt Xl6-菌株的生物被膜形成能力。基因敲除突变株的获得为进一步分析相关调控基因的功能提供科学依据和基础资料。