马铃薯晚疫病菌效应子PITG_16427.2的基因序列分析及功能验证

 马铃薯晚疫病的病原是致病疫霉菌(Phytophthora infestans),该病原菌在侵染马铃薯过程中分泌大量RxLR型效应子,但目前绝大多数RxLR效应子的功能和作用机制尚不明确。本研究成功克隆了致病疫霉菌的一个RxLR效应子PITG_16427.2,在本氏烟中瞬时表达PITG_16427.2,发现该效应子能够抑制6种激发子(INF1、PsojNIP、BAX、SIF2、Avh238、Avh241)激发的植物免疫反应。进一步研究发现,效应子PITG_16427.2在晚疫病菌侵染马铃薯早期上调表达。在15个致病疫霉菌株和3个同属菌株中克隆该基因,克隆到氨基酸序列一致性超过93%的同源基因,这些同源基因均能在本氏烟中抑制INF1和Avh241引起的HR,揭示了该效应子在病原卵菌中序列和功能的高度保守性。在本氏烟和马铃薯感病品种Désirée中瞬时表达PITG_16427.2,发现该效应子能够显著促进晚疫病菌的侵染。通过qRT-PCR方法检测发现,乙烯信号的相关基因ERF1显著上调,而水杨酸信号相关基因PR1b显著下调,表明PITG_16427.2在晚疫病菌侵染过程中可抑制寄主的SA信号途径,促进晚疫病菌侵染。因此,RxLR型效应子PITG_16427.2是致病疫霉菌中一个重要的侵染致病因子。     

利用Cre/lox特异位点重组系统获得无选择标记转AtMYB12基因的马铃薯

类黄酮是植物产生的一类次级代谢产物的总称,长期食用含类黄酮的果实和蔬菜有易于人体健康,目前广泛种植的马铃薯品种中仅含有痕量的类黄酮。AtMYB12是拟南芥中鉴定的调控类黄酮生物合成的特异性转录因子,并在烟草和番茄中得到了功能验证。为了增加马铃薯中类黄酮的含量,本研究构建pX6-patatin：：AtMYB12无选择标记...     

RXLR类效应分子PITG_21645.2的基因序列分析及功能验证

 马铃薯晚疫病黑龙江菌株效应分子PITG_21645.2在本氏烟(Nicotiana benthamiana)上可以抑制由INF1引起的过敏性细胞坏死(Hypersensitive response, HR)。为验证其为致病疫霉致病的重要效应分子,克隆了10个致病疫霉菌株以及3个同属卵菌菌株中的PITG_21645.2同源基因,它们在氨基酸序列上相似度为93%~100%。与INF1共表达的结果显示,仅有PITG_21645.2^MP903丧失了抑制HR的功能。其中PITG_21645.2^MP903的第31位氨基酸存在特异性,编码丝氨酸,其余同源基因在该位点均编码天冬酰胺。PITG_21645.2^MP903回复突变体(S31N)能够恢复该基因抑制INF1引起HR的功能,说明第31位氨基酸是影响抑制功能的关键位点。另外,PITG_21645.2还能抑制BAX、大豆疫霉PsojNIP和效应分子Avh238在本氏烟上激发的HR,而PITG_21645.2^MP903都丧失抑制功能。本氏烟上表达PITG_21645.2能够促进致病疫霉在寄主上的定殖,从而提示PITG_21645.2在致病疫霉的侵染中发挥致病性功能。     

不同番茄品种中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量测定及与抗氧化能力相关分析

为了研究番茄不同遗传种质资源中类黄酮和咖啡酰奎尼酸的含量差别及其与抗氧化能力的相关性,应用HPLC方法分别测定了23个番茄品种的果皮和果肉中芦丁、山奈酚芸香苷、绿原酸、1,5-二咖啡酰奎尼酸和3,4,5-三咖啡酰奎尼酸的含量,并与其抗氧化能力进行了相关性分析。结果表明,在不同品种的番茄果实中类黄酮和咖啡酰奎尼酸的含量差异显著,在同一番茄品种的果皮和果肉中其含量也有较大差别。此外,相关性分析的结果表明,多数所测物质的含量与抗氧化能力均具有一定的相关性。     

CopAB基因突变导致PXO99对铜敏感和致病性降低

Cop基因簇是黄单胞菌属抗铜的主要基因位点,而水稻白叶枯病菌PXO99相对其他菌株对铜离子更加敏感。本研究发现抗铜基因Cop AB的6个氨基酸自然缺失突变是造成PXO99对铜离子敏感的主要因素。通过对Cop AB的缺失突变体和恢复抗铜能力的重组菌株的耐铜实验和接种实验,证实了Cop AB不仅参与黄单胞杆菌的抗铜功能,同时作为一种致病因子参与黄单胞杆菌与水稻的互作。为验证Cop AB基因的功能,从国内白叶枯病菌分离菌株中筛选到4株对铜离子敏感菌株,并证实其Cop AB基因也发生相似的突变。同时,恢复抗铜能力的PXO99互补菌株并不能克服xa13介导的抗性,而分离到的4株铜离子敏感的菌株中,3株不含Pth Xo1的菌株在IR24和IRBB13上致病性相当,说明PXO99对铜离子的敏感性与xa13基因介导的对PXO99专化抗性没有直接的关系。     

玉米纹枯病菌诱导启动子P_(LHT1)核心顺式作用元件的鉴定

玉米纹枯病是玉米上重要的病害之一,前期通过高通量测序筛选到一个受纹枯病菌诱导表达的玉米基因LHT1,为了揭示该基因的调控机制,本研究克隆了该基因的启动子区域(P_(LHT1))并对其病原诱导核心元件进行了鉴定。结果表明,P_(LHT1)包含有4个激发子响应元件、3个GT-1元件、4个SA响应元件、3个ABA响应元件、1个生长素响应元件和1个GA响应元件。该启动子在多个组织器官中高水平表达,且在接种纹枯病菌菌株YWK196后,该启动子在4 h内就能够高效诱导表达报告基因。启动子截短分析发现,-1 416 bp至-1 087 bp区间的缺失使P_(LHT1)丧失了受纹枯病菌诱导的能力,对照Plant CARE的分析结果,该区段含有3个已知的病原菌诱导元件GT-1,将该区段内的3个GT-1进行单个缺失后,发现-1 416 bp至-1 087 bp区段受纹枯病菌诱导的活性减弱并未完全丧失;此外,将3个GT-1元件同时替换为GGGGGG后,-1 416 bp至-1 087 bp区域不再响应纹枯病菌的侵染,这些结果说明,这3个GT-1元件在P_(LHT1)响应纹枯病菌的侵染中协同发挥作用。     

OsHsp18.0-CI调控水稻对白叶枯病的抗性

 热激蛋白广泛存在于各种生物中,响应多种生物胁迫和非生物胁迫。前期研究结果显示,在水稻中超量表达小热激蛋白OsHsp18.0-CI基因,能通过增强水稻的基础防卫反应提高对水稻细菌性条斑病的抗性。本研究发现,OsHsp18.0-CI基因也能够受到白叶枯病菌的诱导表达,超量表达OsHsp18.0-CI的转基因水稻也增强了对多个白叶枯病致病菌株的抗性。转录组测序分析发现,OsHsp18.0-CI基因介导的水稻对白叶枯病的抗病信号途径有部分类似于其介导的对细菌性条斑病的抗性路径,同时也有大量新的未知功能基因的参与。以上结果表明,OsHsp18.0-CI基因受到病原菌的侵染时,也能通过增强水稻的基础防卫反应来提高对白叶枯病的抗性。     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测

 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)是水稻种子产地检疫中最重要的两种检疫对象,且同属于水稻黄单胞杆菌。本研究基于生物信息学技术构建比较基因组学算法对两种病原的全基因组序列比对分析,得到一系列能够区分两种病原的特异性PCR引物。结合简单的PCR技术及全自动DNA分析系统,我们选取了12对引物分别对23株水稻白叶枯病菌和5株水稻细菌性条斑病菌及其它相关菌株进行验证。结果获得了2对显性标记(Xoo-Hpa1和Xoc-ORF2)以及3对共显性分子标记(M568、M897和M1575)可以达到理想的区分检测两种病原的效果。分子标记的检测灵敏度从5×10⁴到5 × 10⁷cfu·mL^-1不等,且从水稻种子浸提液中也能成功地检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌。本研究丰富了检测标记的靶位点,并有效的结合了高通量检测的手段对多位点联合分析,增强了检测的可靠性,有望在今后的植物检疫及病原鉴定中发挥着重要的作用。     

水稻转基因种质IRBB13（PXa13:GFP）感病及育性突变体的筛选及鉴定

 【目的】建立简便高效的水稻突变体筛选体系,为克隆参与调控水稻xa13/ Xa13表达以及xa13/Xa13介导的抗/感病和花粉发育信号途径的基因奠定基础。【方法】利用EMS化学诱变携带显性Xa13启动子驱动绿色荧光蛋白（GFP）基因的水稻转基因种质IRBB13（PXa13:GFP）,构建突变群体,分3个时期进行突变体筛选：幼苗期筛选根和芽中绿色荧光减弱或消失的突变体、成株期筛选回复感病表型的突变体和孕穗期筛选育性下降的突变体。【结果】室内检测代M2突变体株系3 000个,筛到幼根和幼芽荧光消失的突变体14个,根部荧光正常而芽无荧光的突变体9个。田间试验种植突变体株系3 000个,成株期接种PXO99初步筛到回复感病表型的突变体株系25个。孕穗期筛选到育性下降且花药中绿色荧光消失的突变体株系7个,其中,包含1个回复感病的突变体株系。【结论】建立了简便高效的筛选水稻突变体筛选体系,结合GFP表达模式异常的突变体、回复感病突变体以及育性下降的突变体分析可判断xa13/Xa13参与的水稻抗/感病与花粉发育这2条信号网络途径并不是完全独立的,而是存在一定程度的交叉。     

过表达嗜热毛壳菌Cu/Zn-SOD基因提高转基因水稻对3种病害的抗性

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD,EC1.15.1.1)是生物体中清除氧自由基、保护细胞免受氧化损害的关键保护酶之一,SOD活性的提高可以增加植物对各种不良环境的适应和耐受能力。本研究将一个源自嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum,Ct)的Cu/Zn-SOD基因Ct SOD通过农杆菌介导的遗传转化方法转入水稻,转基因植株的SOD活性均得到显著提高。对转基因植株分别接种水稻白叶枯病、细菌性条斑病以及纹枯病的病原,发现过量表达Ct SOD能够显著提高转基因植株对3种病害的抗性。这种对多种病害具有抗性的单个基因在植物抗病育种中具有重要应用价值。