利用花粉介导法获得油菜RNAi转基因植株

以甘蓝型油菜7B为试验材料,利用花粉介导法将携带RNA干扰的HKL1基因的pCaMHKL1-RNAi质粒转入7B中,获得转基因油菜植株,通过PCR分别对T_1,T_2植株进行了转基因鉴定,并对转基因植株后代的生长发育进行研究。结果表明,T_2的RNAi植株与野生型植株相比,出真叶时间较晚,株型较矮小;qRT-PCR结果表明,RNAi植株中HKL1基因的相对表达量为野生型植株的24.6%~67.9%;不同的RNAi植株中HKL1基因的表达量各不相同;利用花粉介导法在甘蓝型油菜中进行RNAi质粒转化,外源基因可以在后代植株中稳定遗传。花粉介导法较之农杆菌侵染、基因枪法等基因转化方法操作更加简单、适用性更强。     

油菜农杆菌介导转化体系的优化

以甘蓝型油菜湘油15号为试验材料,对农杆菌转化体系中外植体预培养时间、培养基中AgNO_3浓度、农杆菌侵染时的菌液浓度、共培养基pH值等进行了优化研究,确立了优化的遗传转化条件。结果表明,外植体在农杆菌侵染和共培养前预培养3 d,可明显提高子叶外植体和下胚轴外植体出愈率和抗性芽苗分化率,有利于获得较高的转化效率;在基因转化中,AgNO_3的最佳使用浓度为30μmol/L,最佳的农杆菌侵染菌液OD_(600)为0.4,共培养基pH值5.4是油菜农杆菌介导转化中优化的转化条件。     

激素组合等在甘蓝型油菜下胚轴再生中的作用

激素和基因型对油菜外植体的高效再生具有重要作用。试验以甘蓝型油菜湘油14号、湘油15号和Y03-211共3种油菜基因型为材料,对不同浓度组合的6-BA,NAA,GA3,AgNO3组成的18种培养基在下胚轴植株再生中的作用进行研究,以明确不同激素种类在外植体再生中的作用,进而建立甘蓝型油菜下胚轴高效再生体系。结果表明,在供试的18种培养基中,所有材料都能获得80%以上的出愈率。但是不同培养基下胚轴再生率差异显著,其中,6-BA对油菜下胚轴再生植株的分化是必需的;6-BA与GA3组合优于6-BA与NAA组合;在培养基其他成分相同的条件下,添加AgNO3能够明显提高正常芽苗分化率;不同品种的再生植株分化能力不同。油菜生根使用生长素NAA比使用IAA诱导或不使用植物激素诱导的生根效果更好。基因型、激素组合以及培养基中AgNO3的添加对再生植株的分化具有重要影响,其中,MS+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3+20μmol/L AgNO3培养基最有利于诱导再生植株分化;MS+0.2 mg/L NAA培养基最有利于诱导再生芽苗生根。