嗜热革节孢内切葡聚糖酶EGⅠ中精氨酸Arg7的功能分析

本研究将嗜热革节孢GH45家族内切葡聚糖酶EGⅠ中的底物结合位点精氨酸Arg7进行饱和突变,测定其性质、动力学参数的变化,以期分析精氨酸Arg7的功能。结果表明,与原酶相比,突变酶R7A的K_m有所下降,R7P的k_(cat)显著性提高,但突变酶的k_(cat)/K_m均显著性降低。原酶的最适反应温度为50℃,突变酶R7C、R7P和R7V的则为40℃,其余突变酶的均为50℃。原酶于70℃下处理2 h具有61%的活性,相同处理条件下,突变酶R7F、R7H仍具有70%以上的活性,说明其热稳定性明显提高,R7A仅有20%的活性,剩余突变酶均有40%左右的活性。原酶的反应最适pH值为5. 0,而突变酶R7C的为6. 0,剩余突变酶的均为5. 0。本试验探究了精氨酸Arg7饱和突变后嗜热革节孢GH45家族内切葡聚糖酶的性质变化,可为GH45家族进一步的分子改造和功能研究提供参考。     

嗜热子囊菌光孢变种cbh1基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达

以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。     

陕西省玉米穗粒腐病的病原菌鉴定及各分离菌分布频率

1992～1993在陕西省汉中、宝鸡、咸阳、安康、商洛、榆林等地区的25个县、62个乡调查玉米穗粒腐病,并采集病穗标样570份。霉坏籽粒占果穗面积1/3以上、发病严重的果穗占35.61%。对病穗标样分离鉴定结果,按出现频次计:Fusarium moniliforme占42.58%,F.graminearum 20.34%,依次还有Rhizopus nigricans(13.59%)、Penicillium sp(7.95%)、Trichothecium roseum(4.21%)、Cephalosporium acremonium(2.37%)、Olpitrichumofricanum(1.91%)、F.brachygibbosum(1.15%)、Acremoniella verrucosa(1.07%)、Bipolariszeicola(0.92%)等。串珠镰刀菌F.moniliforme出现频次占优势,是陕西省玉米穗粒腐病的主要病原菌。     

两嗜热真菌中国新记录种

在对山东、陕西及云南的标本研究中鉴定出两个嗜热真菌中国新记录种，即亚拉巴马枝顶孢，米黑根毛霉，对其进行了描述和讨论。亚拉巴马枝顶孢的主要特征是其深色菌丝、瓶梗产孢及顶生分生孢子；米黑根毛霉的主要特征是产生带假根孢囊梗，单孢子培养产生大量接合孢子。研究标本保存在山东农业大学植物病理学标本室(HSAUP)。     

玉米穗粒腐病接种技术及品种抗病性鉴定

以玉米穗粒腐病的优势病原菌串珠镰刀菌Fusarium moniliforme为接种菌源,采用4种接种方法进行比较,以针刺果穗较深处(籽粒与穗轴间)发病最重,花丝喷雾法发病最轻;接种时期以玉米乳熟期接种为好;接种浓度10×40倍下每视野60个分生孢子;接种量以每果穗接种2.5ml孢子悬浮液发病最重。同时规范了病情分级标准及品种抗、感程度划分标准。采用规范程序,对63份玉米自交系及杂交种进行了抗病性鉴定。     

黄蓝状菌几丁质酶基因tfchi1的克隆、表达及抗菌活性

 为研究黄蓝状菌（Talaromyces flavus）几丁质酶性质和作用,通过RT PCR、3′ RACE及5′ TAIL PCR技术克隆了一个黄蓝状菌几丁质酶基因tfchi1,该基因全长为2 561 bp,含有6个内含子,包含一个1 194 bp的ORF,编码397个氨基酸,分子量为43.47 kDa,属于糖苷水解酶第18家族。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体pPIC9K/tfchi1,并转化毕赤酵母,筛选得到一株高效表达几丁质酶的工程菌GS TFCHI1 9,甲醇诱导第7 d酶活性最高,达32.29 U·mL-1。SDS PAGE检测纯化重组蛋白的分子量约44 kDa。重组几丁质酶Tfchi1最适反应温度为35℃,最适反应pH值为5.5,在pH 6～8之间稳定。Zn2+、Cu2+对 Tfchi1活性有明显的抑制作用。抑菌活性测定结果显示,Tfchi1可明显抑制敏感植物病原真菌的菌丝生长和分生孢子萌发。该酶在几丁质资源的开发利用和生物防治等领域具有较广的应用前景。     

菌寄生真菌纤细齿梗孢一丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因OPK1的克隆及序列分析

 Using degenerate PCR and TAIL-PCR, a protein kinase gene OPK1 (Genebank accession No.:EU417815) was cloned from mycoparasite fungi Olpitrichum tenellum. OPK1 has an open reading frame of 2 031 bp interrupted by two introns (108 bp, 84 bp) and putatively encodes a protein of 676 aa. Phylogenetic analysis indicated that OPK1 was most similar to other serine-threonine protein kinase in fungi. Southern blot analysis indicated that OPK1 is present as a single copy in the genome. RT-PCR showed it could be transcribed both in the phase of spore germination and hyphal growth.     

纤细齿梗孢丝氨酸蛋白酶cDNA克隆及其序列分析和表达

纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum是一种寄生在轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides上的活体营养菌寄生真菌。丝氨酸蛋白酶在菌寄生过程可能起到重要作用。根据丝状真菌丝氨酸蛋白酶的同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法,克隆得到1845bp的全长cDNA片段。其可读框为1554bp（GenBank登录号为EU368754）,编码517个氨基酸的蛋白质。比对分析发现该蛋白是一种分泌型的丝氨酸蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信号肽-前肽-成熟肽的结构。将该基因可读框除去信号肽插入酵母表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,在甲醇诱导下成功分泌出具有生物活性的重组蛋白酶,诱导120h后酶活性可达153U/ml。重组蛋白酶经DEAE-Sepharose层析进行纯化,SDS-PAGE分析其分子量为39kD。其反应的最适温度为60℃,最适pH为8。     

大豆根内胞囊线虫的时空动态研究

于2006-2007年田间自然生长条件下,研究大豆苗期(7~37 d)胞囊线虫(4号生理小种)在根系的时空分布动态。结果表明,大豆胞囊线虫分布与根系生长状况有密切关系。出苗后7 d已有线虫侵入根内,随着根系生长发育,单位根长线虫数以及线虫总数增多,单位根长内线虫数量呈S型曲线变化。随着出苗后天数的增加,主根和侧根内线虫数量变化呈相反趋势,其中主根内线虫密度减少,侧根内线虫密度增加至相对稳定值。随着土层的加深,主根和侧根内线虫密度差异减小;5~15 cm土层根系内线虫数量及其所占比例均最大。说明苗期大豆胞囊线虫主要分布在5~15 cm土层。     

嗜热革节孢第十二家族内切葡聚糖酶的定点突变

纤维素酶有广泛的应用前景,探究纤维素酶的性质及其催化作用机制有重要意义。本研究对嗜热革节孢第十二家族内切葡聚糖酶steg1基因进行定点突变,研究突变对酶活性的影响。选择位于酶催化活性通道上的6个氨基酸位点(N35、W37、Y77、W128、Y145、N168)进行突变,得到8个突变酶(N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145F、Y145A、Y145W、N168Q)。结果显示,与野生酶WT相比,所有突变酶的活性降低,其中突变酶Y77F、W128S、Y145A的Km值和kcat值都降低;N35Q的Km和kcat值都升高;W37H、Y145F、Y145W、N168Q的Km值升高,kcat值降低。WT与突变酶的最适p H值为5.0,均保持不变。突变酶Y77F、N35Q的最适温度降低到50℃,WT和其余突变酶的最适温度为55℃。突变酶Y77F和N35Q在60℃处理10 min后分别保持49.34%和22.90%的活性,WT和其余突变酶在60℃处理10 min后都失活。本研究为探究内切葡聚糖酶的催化作用机理以及分子改造奠定基础。