植物类病变突变体及其信号传导途径

植物类病变突变体是研究细胞程序性死亡和防卫反应的理想材料。越来越多的研究表明,类病变突变体易受环境因子和遗传背景的影响。本文综述了植物类病变突变体的发生机制及相关的信号传导途径,以期对植物超敏反应的研究提供有益的借鉴。     

稻瘟病抗性基因的克隆及应用研究进展

稻瘟病是水稻三大病害之一,每年都给水稻生产造成巨大损失,挖掘并合理利用品种自身抗性是解决稻瘟病危害的最有效途径。本文综述了水稻稻瘟病抗性基因克隆、功能标记开发以及稻瘟病抗性分子标记辅助选择育种研究进展,为进一步克隆、研究、应用稻瘟病抗性基因提供理论指导。     

水稻两用核不育系龙S抗稻瘟病主效基因的定位

龙S是一个广谱抗稻瘟病的水稻两用核不育系,利用分子标记技术精细定位其主效抗性基因,对于培育抗稻瘟病水稻新品种具有重要意义。采用来自国内外的41个稻瘟病菌系通过接种鉴定方式对龙S进行了稻瘟病抗谱分析,结果显示龙S的抗性频率为100%,对其中39个菌系表现高水平抗性,与Pi9的携带品种75-1-127抗性频率和抗病级别基本相当。群体遗传分析表明龙S的抗性基因表现为显性遗传方式,对于不同菌系龙S表现出不同的抗病遗传模式,其中龙S对稻瘟菌系318-2的抗性由单基因控制。通过抗病亲本龙S与感病亲本日本晴构建F₂分离群体,采用BSA (bulk segregant analysis)及RCA (recessive class analysis)分析方法,将龙S的主效抗病基因精细定位于第9染色体上的SSR标记M1-M2所在的1.31 cM区间,与已克隆的广谱抗稻瘟病基因Pi5位于相邻的染色体区域。抗谱分析表明,龙S与Pi5、Pii单基因系的抗性频率差异明显,抗谱较后二者更广。龙S主效抗性基因的精细定位,为进一步揭示其与Pi5、Pii的等位关系以及通过分子标记辅助选择培育抗病水稻新品种奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

一个水稻早衰突变体基因的精细定位

【目的】对水稻叶片早衰突变体W330进行遗传分析及精细定位,获得控制突变表型的基因。【方法】用60Co-γ辐射诱变籼型水稻恢复系中恢8015,从突变体库获得一份叶片早衰突变体W330。对该突变体进行表型观察和主要农艺性状调查。利用多代自交稳定的突变体W330与粳稻品种02428杂交,观察F1和 F2的表型,并统计F2群体中早衰突变表型与正常野生型的分离情况,分析该突变表型的遗传行为。利用构建的F2群体进行精细定位和候选基因分析,然后对候选基因进行DNA测序、酶切分析、表达分析、酶活测定及进化分析。【结果】突变体W330从三叶期开始出现叶片衰老,直至抽穗期及黄熟期。与野生型相比,突变体W330株高变矮、分蘖减少、叶片变窄、抽穗期不变、每株有效穗数、每穗着粒数和结实率亦显著降低。W330与02418杂交的F1表现正常,F2群体中正常植株与早衰突变植株的分离比符合3﹕1,表明突变体W330的突变性状受1对隐性核基因控制。利用F2定位群体及SSR、Indel标记,最终将目标基因定位在第3染色体短臂上2个分子标记CD-5与CD-7之间,物理距离约为21.5 kb。基因预测表明该区域共有4个完整的ORFs。其中,LOC_Os03g0131200编码一个过氧化氢酶OsCATC,基因组序列分析表明,W330突变体中的该基因从ATG开始第109位,在第一个内含子的末位发生了一个C到G的颠换,造成第一个内含子没有剪切,最终导致翻译提前终止,酶切试验验证了这一突变位点。与野生型亲本中恢8015相比,W330突变体在三叶期叶片中的过氧化氢酶的活力下降了47.8%,而过氧化氢含量上升了2.7倍。由此,推定W330与OsCATC等位。系统进化分析发现,OsCATC与水稻中同源的过氧化氢酶不在同一进化分支上。实时荧光定量PCR发现,与其野生型相比,突变体W330叶片中的OsCATA和OsCATB的表达量显著上升,而OsCATC的表达量没有明显的变化。推测,这3个高度同源的基因在水稻体内可能存在互补机制。【结论】W330突变体基因是已报道的过氧化氢酶基因OsCATC的等位基因。W330突变体在第一个内含子上发生的一个点突变造成可变剪切的发生,使得水稻一个过氧化氢酶失活,导致突变体W330突变表型的出现。     

水稻早衰突变体es5的鉴定及其突变基因的精细定位

【目的】对水稻叶片早衰突变体es5进行遗传分析及精细定位,探索水稻叶片衰老的分子机制。【方法】es5是嘉禾212经EMS诱变获得的一个叶片早衰突变体。利用es5与籼稻中恢8015杂交获得F1,F1自交获得分离群体F2。在杭州和海南观察F1和F2的表型,并分析该突变表型的遗传行为。取F2中隐性单株,利用图位克隆方法精细定位该基因。抽穗期时对突变体和野生型叶片进行SOD活性、MDA含量、可溶性蛋白含量、叶绿素含量、净光合速率测定、组织化学分析、透射电镜观察以及衰老相关基因的表达量分析。成熟后调查es5和嘉禾212的几个重要农艺性状。【结果】四叶期前es5表型与嘉禾212相比无明显差异,四叶期时下部叶片叶尖开始黄化衰老,随着植株的生长发育,叶片的衰老面积逐渐变大,至拔节期,中下部叶片黄化衰老严重。与野生型相比,es5的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量和净光合速率均显著下降,es5的株高、有效穗数、每穗总粒数、千粒重、结实率等农艺性状都极显著下降。伊文思蓝染色和二氨基联苯胺染色分析结果表明,es5叶片中含有更多的死亡细胞和过氧化氢积累。酶活性和衰老相关参数的测量结果显示抽穗7 d和抽穗21d,es5叶片中的SOD活性均显著高于嘉禾212中SOD活性;抽穗21 d时,es5中MDA含量显著高于嘉禾212中MDA含量;抽穗7 d和抽穗21des5叶片中可溶性蛋白含量均极显著低于嘉禾212中可溶性蛋白含量。透射电镜观察结果表明es5衰老部位细胞质溶解,叶绿体结构异常,叶绿体膜溶解,基粒模糊,基质片层疏松,类囊体发育异常,淀粉体和嗜饿颗粒增多。qRT-PCR结果显示es5中促进衰老的基因Osh36、Osh69、OsI85、RCCR1表达量极显著上调。2个衰老的标志基因Osh69和OsI85表达量分别上调12.7和36.6倍。同时叶绿素降解相关基因SGR也显著上调。遗传分析结果表明该性状是由单隐性核基因控制。采用图位克隆的方法将该基因精细定位在第5染色体上的BF-10和RM3664两标记之间,物理距离约52.7 kb,该区间包含8个开放阅读框。【结论】es5由于叶片的过早衰老造成与产量相关的几个重要农艺性状显著下降。将该基因定位在第5染色体介于标记BF-10和RM3664之间52.7 kb的物理区间内。     

水稻类病斑突变体lm8015-2的鉴定与基因的精细定位

【目的】为进一步解析水稻抗病分子机制,对类病斑突变体lm8015-2进行了鉴定。【方法】利用EMS诱变籼稻中恢8015,从其后代中鉴定出一个类病斑突变体lm8015-2。对突变体lm8015-2及其野生型的叶片进行超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢含量、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、光合色素含量、防御基因表达量的测定。将粳稻02428与突变体lm8015-2杂交获得的F₂群体用于遗传分析,采用图位克隆的方法对目的基因进行精细定位。【结果】突变体的红锈状斑点自播种3周后于叶尖出现,分蘖期缓慢扩散至全叶及整个植株,至抽穗期可致整个叶片枯亡。lm8015-2类病斑的产生受自然光的诱导,其叶片的光合色素含量明显低于野生型。EB染色与DAB染色结果表明,lm8015-2中发生了大量的过氧化氢沉积与细胞死亡。与野生型相比,lm8015-2中超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性显著上升,同时伴有可溶性蛋白含量下降和丙二醛含量上升。遗传分析表明,lm8015-2类病斑表型由一对隐性核基因控制,该基因位于第5染色体的W32-85和C32-8两个引物之间,物理区间为104 kb。测序结果表明该区间内候选基因LOC_Os05g48390的起始密码子(ATG)发生了单碱基替换突变(T变为A),导致起始密码子缺失。qRT-PCR结果表明,lm8015-2中部分防御基因被激活,表达显著上调。【结论】LM8015-2与LTN1互为等位基因,其突变可能增强了部分防御基因的表达。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

【目的】CRISPR/Cas9基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑，以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以Pita、Pi21和ERF922为靶基因，构建共编辑载体pC1300-2×35S::Cas9-gPita-gPi21-gERF922 ，用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014，筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。【结果】在T0代转基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突变频率分别为75%、85%和65%，突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代，并从中获得Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明，与野生型相比，突变株系的抗性显著提高。同时，接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此，我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。【结论】利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系，为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

SSR分子标记在稻瘟病抗性育种中的应用

稻瘟病俗称水稻癌症,每年都造成严重损失。实践证明,发展抗性育种是解决这一问题最有效的方法之一。SSR分子标记为辅助选育抗稻瘟病水稻新品种和抗性鉴定提供了新的方法和手段。阐述了SSR分子标记在水稻遗传连锁图谱构建、稻瘟病抗性基因定位、稻瘟病菌危害研究、分子标记辅助育种当中的应用,以为以后的研究奠定基础。