绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义.     

应用A蛋白夹心酶联免疫吸附法鉴定黄瓜花叶病毒血清组

根据Ａ蛋白夹心酶联免疫吸附法（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）试验结果可以将我国分离的１６个黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）分离物及４个ＣＭＶ标准毒株（Ｆｎｙ、Ｌｎｙ、Ｍ、ＷＬ）区分为２个血清组．１４个分离物及标准毒株Ｆｎｙ、Ｍ属ＤＴＬ血清组，２个分离物及标准毒株Ｌｎｙ、ＷＬ属ＴｏＲＳ血清组     

棉花皱缩花叶病的初步研究

2007年湖北荆州地区一些棉田棉花叶片上发生一种新的棉花病害,暂定名为棉花皱缩花叶病。通过症状描述、电镜观察和生物学接种对其进行了初步分析。结果显示:该病害症状疑似病毒病,但与已经报道的棉花病毒病症状都不相同。电镜观察显示,病株叶片汁液中存在4种杆状病毒颗粒,大小分别约是18nm×300nm、18nm×500nm、18nm×800nm、18nm×1100nm。生物学接种结果表明,该病不能经种子、棉蚜、烟粉虱、汁液摩擦4种方式传播。     

植物病毒RNA间重组的研究现状

根据近几年来研究的最新资料，从植物病毒ＲＮＡ间的重组位点的特征以及重组体亲本链双方的来源的角度对植物病毒ＲＮＡ的重组类型作了介绍，并对其重组机制作了综述。     

中国原野上有野马吗——访新疆野生动物科研、管理人员

史书记载,被人早就驯养的马,一直与人类二千多年的文明史和战争史紧密关联着。由于习见不怪,所以北京动物园里被驯化得毫无野性的并不比家马长得美的普氏野马,总不如黑白分明、憨厚可爱的大熊猫招徕的游客多。然而,许多动物学家却象关心大熊猫一样关注着野马。据有关方面同志说,目前大熊猫在全国野外分布着千余只,而普氏野马除分散在世界各动物园里饲养、展览的三百多匹外,十多年来在荒原上没有再发现过,自十九世纪末期(1876年),欧洲野马从乌克兰原野上消失之后,世界上唯一生存的野生马——普氏野马在地球上有没有绝迹,成了世界动物学家瞩目的问题。我国新疆和蒙古人民共和国接壤的地     

水稻条纹病毒的分子生物学

综述了近年来国内外有关水稻条纹病毒在基因组结构、功能、复制、转录、表达策略及其分类地位、病毒分子变异和病害控制策略以及进化上的亲缘关系等方面的最新研究进展 ,并就如何进一步开展深入研究进行了讨论     

可持续植物保护及其综合评价

本文探讨了可持续植物保护的内涵及特征，讨论了建立指标体系的原则和框架模式，建立了具有递阶层次结构的可持续植物保护综合评价指标体系，给出了确定指标权重的层次分析方法并算出了各层指标的权重，制定了单指标可持续度及植保系整体可持续度的计算公式，给出了可持续性动态评价的模型和方法。     

小分子植物病毒抑制物质研究进展

论述了小分子病毒抑制物的结构及对病毒的抑制机理 ,讨论了植物病毒抑制剂研究中存在的问题及研究前景     

不同钾镁施用水平下甘蔗花叶病对甘蔗产量的影响

在甘蔗伸长盛期,SCMV—A侵染的蔗株叶片中蔗糖含量明显低于健株,还原糖含量则相反;不同钾、镁肥施用水平下,SCMV—A侵染的蔗株均比对照健株显著矮化,蔗茎和蔗糖含量均显著降低.而蔗茎锤度、蔗糖和还原糖含量则因钾、镁肥施用量的不同或高或低于其相应健株;适量施钾可增加健株的蔗茎及蔗糖产量,又可部分减少由SCMV—A年致的产量损失.施镁肥也有部分减少由SCMV—A引致产量损失的效果.