马尾松PmPIN1基因的克隆及功能分析

【目的】PIN1基因通过调控生长素极性运输的方式在植物根系生长发育中发挥作用。对马尾松PmPIN1基因进行全长克隆和功能分析,有助于在分子水平揭示马尾松的生根机制。【方法】运用PCR和RACE技术成功克隆马尾松PmPIN1基因cDNA序列;利用生物信息学软件分析PmPIN1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;通过实时荧光定量分析PmPIN1基因在10年生马尾松幼根、1年生枝条、新叶、花中的表达量差异;利用农杆菌侵染法将PmPIN1基因转入烟草获得转基因植株,比较转基因烟草与转pCAMBIA-1302空白载体烟草之间的表型差异;用激光共聚焦显微镜观察PmPIN1-GFP荧光蛋白在转基因烟草根中的表达模式;酶联免疫法测定野生型和转基因烟草的根、根茎结合处及叶中的生长素含量;用不同浓度的生长素极性运输抑制剂1-N-萘基邻氨甲酰苯甲酸(NPA)处理野生型与转基因烟草,分析烟草根、根茎结合处、叶中的生长素含量变化;利用PEG介导法将16318-hGFP-PmPIN1重组载体转化至拟南芥原生质体中进行亚细胞定位分析。【结果】PmPIN1基因全长2914bp,包含2085bp的ORF,编码的蛋白由695个氨基酸组成,N端与C端均有膜运输蛋白。系统进化树显示马尾松与油松在发育树同一支上。通过实时荧光定量发现PmPIN1在不同组织中的表达量差异达到极显著,1年生枝条与幼根中表达量较高,花中最低。农杆菌介导法转化烟草获得的转基因烟草,较转空载烟草株高增长,生根量增加且根系变长。激光共聚焦显微镜观察得出转基因烟草根部中间有明显绿色荧光富集现象。酶联免疫法测定结果表明转基因烟草根、根茎结合处生长素含量高于野生型,且叶较根和根茎结合处减少。不同浓度NPA处理后,野生型烟草根中生长素含量变化达极显著,且生长素含量随NPA处理浓度的增加而减少;处理浓度为10nmol·L~(-1)时,叶中生长素含量最高;处理浓度为2nmol·L~(-1)时,根茎结合处生长素含量增加较多。不同浓度NPA处理后,转基因烟草不同部位生长素含量变化均未达到极显著。亚细胞定位分析表明PmPIN1蛋白主要分布于细胞膜上。【结论】马尾松PmPIN1与油松PIN1亲缘关系最近。PmPIN1属于膜蛋白。PmPIN1转基因烟草可能提高生长素由地上部位向地下部位的运输能力,减少NPA对生长素含量变化的影响,表明PmPIN1可能调控生长素的极性运输;PmPIN1-GFP绿色荧光富集在根部中间部位,PmPIN1在幼根中表达量较高,转基因烟草较转空载植株发根量多,根长长。研究结果表明PmPIN1基因可能在根系发育中发挥重要作用。     

干旱对马尾松幼苗光合作用及相关生理的影响

为了解干旱胁迫对马尾松幼苗生长、生理及光合特性的影响,揭示不同抗旱时期马尾松幼苗中各种物质含量的变化规律及抗旱机制,以1年生马尾松幼苗为试材,采用温室土培盆栽进行干旱胁迫处理,对胁迫0、15、30、45、60天的马尾松幼苗分别测定相关生理生化及光合特性指标。结果表明,随干旱胁迫程度加剧和胁迫时间延长,马尾松幼苗根冠比略上升,严重胁迫下苗高生长量、地径生长量及干物质积累,比正常浇水(CK)分别降低了69.89%、70.73%、75.58%;马尾松幼苗中的过氧化物歧化酶、过氧化物酶的活性呈先升后降趋势,处理30天时中等和严重胁迫处理均达峰值699.81、817.82 U/g,比正常供水分别上升75.57%、104.01%;45天时过氧化物歧化酶的活性仍较高,而严重胁迫下过氧化物酶活性达峰值319.00 U/(g·min),比正常浇水分别高171.88%,与正常浇水呈显著性差异;丙二醛、脯氨酸含量逐渐上升;生长指标根冠比与生理指标丙二醛、蒸腾速率、茎生物量、气孔导度之间,气孔导度与根生物量均呈很强的正相关(r=1);但脯氨酸与净光合速率呈显著负相关(r=-1)。马尾松幼苗通过调整生长和生物量分配抵御干旱胁迫;水分亏缺引起马尾松幼苗蒸腾作用和光合作用减弱;干旱初期通过快速增加抗氧化性酶活性保护幼苗过氧化伤害,中后期则增加渗透调节物质,维持细胞内渗透压缓解膜质损伤;马尾松通过调整光合及相关生理机制,制约与协调不同组织应对干旱胁迫。