长足大竹象成虫各段肠道纤维素酶活性比较

为比较和客观评价昆虫肠道各段内纤维素酶的活性,在不同pH及不同温度下分别测定长足大竹象成虫肠道3段(前、中、后)内3类纤维素酶的活性。结果表明:长足大竹象成虫肠道内有完整酶系,长足大竹象成虫前肠中CX酶的适应温度以及pH的范围较广,具有更强的稳定性,最适温度(T)在50～70℃,最适pH为6～8,在高温和强碱条件下均为检测出酶活性,且前肠中的C_1酶较其他两段存在最大的酶活性,为0.0349μmol·min~(-1)·mg~(-1)(pH值=3,T=40℃)。长足大竹象成虫中肠中C_1酶的适应范围远大于其余两种,最适温度为30～70℃,最适pH值为5～8,在强酸、强碱情况下均未检测出酶活性。长足大竹象成虫后肠中的3中酶的最适温度区间都为30～50℃,最适pH值区间为5～8,较前、中肠两段的最适温度、pH值区间较窄。     

青杄转录因子PwERF8及其启动子序列的克隆与分析

【目的】AP2/ERF是植物的转录因子家族之一,广泛参与生物胁迫和非生物胁迫过程。从青杄中克隆ERF类转录因子PwERF8及其启动子序列,研究PwERF8基因的表达特性、启动子序列功能,并进一步分析其对非生物胁迫的响应模式,为深入了解青杄的耐逆调控机制提供理论基础。【方法】通过RACE-PCR技术获得青杄PwERF8编码区全长序列。通过染色体步移技术克隆PwERF8启动子序列。通过PlantCARE在线软件和BDGP在线软件预测启动子序列上的顺式作用元件、基础启动子和转录起始位点,构建pBI121-PwERF8 promoter∷GUS启动子表达载体,采用农杆菌注射法瞬时转化烟草叶片来验证启动子的功能。构建PGBKT7-PwERF8载体,转化AH109酵母菌株验证其转录激活活性。构建35S∷PwERF8-GFP融合表达载体,通过PEG介导瞬时转化拟南芥原生质体进行基因表达的亚细胞定位分析,应用RT-qPCR技术分析该基因的组织特异性和在非生物胁迫下的时空表达特征。【结果】PwERF8基因的编码区全长序列共1 191 bp,开放阅读框共765 bp,开放阅读框翻译成255个氨基酸。在肽链的N端具有1个保守的由58个氨基酸组成的AP2结构域,在C端含有1个EAR转录抑制基序(DLNLPP)。组织特异性表达分析表明,PwERF8在茎、根、针叶、花粉、种子中均有表达,但在花粉中,PwERF8的表达量最高,其次为种子,在茎中的表达量最少。酵母单杂交试验表明,PwERF8蛋白不具有转录激活活性。亚细胞定位分析发现PwERF8蛋白主要定位于细胞核。将启动子序列进行在线分析显示PwERF8含有GA、ABA、JA和SA等激素的顺式作用元件。进一步在烟草中瞬时过表达PwERF8启动子并用GUS染色显示,PwERF8启动子能响应GA、ABA、MeJA和SA等外源激素的处理。GA、ABA、MeJA和SA分别处理青杄幼苗3、6、12 h后,PwERF8的表达量均显著高于对照,干旱、4℃和42℃处理均能诱导PwERF8表达,但盐胁迫不能诱导其表达。【结论】青杄转录因子PwERF8参与了GA、ABA、JA和SA激素的信号通路,广泛响应干旱、温度逆境等非生物胁迫,且可能作为一个转录抑制子在细胞核中发挥功能。     

青杄类伸展蛋白基因PwELP1的克隆及表达分析

【目的】克隆青杄类伸展蛋白(extensin-like proteins,ELPs)基因PwELP1并分析该基因的表达特性,为研究ELP基因家族的功能奠定基础。【方法】以青杄cDNA文库为模板,用RACE-PCR方法克隆青杄类伸展蛋白编码基因PwELP1的cDNA全长,利用DNAMAN确定PwELP1的编码框及蛋白氨基酸的翻译,运用clustalx软件与Espript工具进行多序列比对,利用MEGA 5软件的邻位相连法构建系统树,并对编码蛋白进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测PwELP1基因在青杄不同组织中表达的特异性、花粉和种子不同萌发时期及幼苗受到不同逆境处理时的表达差异,分析该基因的组织发育及逆境响应表达特点。【结果】PwELP1基因全长832bp,其编码一个由159个氨基酸组成的蛋白,该蛋白的N端与C端均有比较保守的结构域;此蛋白二级结构由1个α-螺旋、5个β-折叠与3个β-转角结构构成,对其三级结构的预测印证了这一结果,同时发现该蛋白中还存在部分无规则卷曲。其分子质量为17.03ku,理论等电点为5.81。PwELP1在青杄花粉中的表达量较高,且在花粉萌发后期(30~36h)以及种子萌发初期(第2天)表达量高;PwELP1的表达不同程度地受低温、高温、茉莉酸甲酯(MeJA)、H_2O_2、脱水以及脱落酸(ABA)等非生物逆境胁迫处理的诱导,尤其是H_2O_2、高温和ABA,处理初期表达量就显著升高。【结论】PwELP1在青杄花粉和种子萌发过程中可能发挥重要功能,并可参与青杄对非生物逆境胁迫的响应过程。     

慈竹ARF基因的鉴定及虫害胁迫下的表达

植物生长素响应因子(ARF)参与调节了植物的向性运动、子叶发育、胚胎形成、叶片器官衰老、维管束形成等,在植物生长发育过程发挥重要调控作用。为研究慈竹ARF基因家族及虫害胁迫下的表达,通过查询慈竹竹笋转录组数据库,分离出24个ARF基因家族成员。利用生物信息学方法分析,发现慈竹ARF家族序列保守,与毛竹亲缘性较近。通过对慈竹竹笋转录组中ARF基因表达模式分析发现,大部分ARF基因在竹笋中表达,少数ARF基因表达量在受到虫害胁迫后表达量发生显著变化。qRT-PCR结果表明,ARF基因在竹笋的几个部位在虫害胁迫后表达量均显著变化,推测其可能参与了竹笋对虫害胁迫响应,且在笋毛中表达量均升高,推测笋毛在抵御虫害胁迫中发挥了重要作用。     

应用液相色谱-串联质谱测定慈竹笋壳提取物成分及其抑菌活性

通过索式抽提的方法从慈竹笋壳中提取活性物质,并用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定其组成成分.采用K-B抑菌圈法测定慈竹笋壳提取物对4种细菌及2种真菌的抑菌效果,同时测试了笋壳提取物的最小抑菌质量浓度及试验温度、处理时间对其抑菌作用的影响.结果表明:慈竹笋壳提取物包含388种代谢产物,且有20种代谢物的质量超过了整个代谢物总质量的1％.慈竹笋壳提取物能够有效抑制大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌这4类细菌,对桔青霉菌、海绵胶煤炱菌2种真菌无明显抑制作用.其中,肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为4.375 g·L-1,金黄色葡萄球菌、粪肠球菌最小抑菌质量浓度为8.750 g·L-1.抑菌活性具有热稳定性,且随浸泡时间的增加,抑菌活性也会提升.