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【目的】 利用腺病毒AdMax系统表达载体表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein),并研究其免疫原性。【方法】 参考GenBank中已公布的PRRSV N基因序列(登录号:KT945017.1),人工合成PRRSV N基因,并将其连接至腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建重组穿梭质粒pDC316-N。将重组穿梭质粒pDC316-N与AdMax腺病毒系统的骨架质粒PBHGLOX (delta) E1,3Cre共同转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-N,对获得的重组腺病毒液进行PCR和测序鉴定,用鉴定正确的rAd-N病毒液感染293A细胞,对该重组腺病毒进行扩大培养,检测病毒的TCID50,并用RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的表达和反应原性。用重组腺病毒免疫小鼠,收集血清用PRRSV抗体检测试剂盒检测其抗体水平,初步评价其对小鼠的免疫效果。【结果】 PCR扩增出1条大小为400 bp的PRRSV N基因条带,测序结果正确,表明重组腺病毒构建成功,浓缩后测得其半数组织培养感染剂量(TCID50)为10-10.239。RT-PCR和Western blotting检测结果证实目的基因在基因和蛋白水平上均可得到正确表达,蛋白分子质量约为14 ku。小鼠特异性抗体检测表明,重组腺病毒rAd-N免疫小鼠后可使小鼠快速产生PRRSV特异性抗体,与对照组差异显著(P<0.05),其中重组腺病毒与Gel佐剂配合使用时效果最好,最高可达7.84 U/L。【结论】 本研究成功构建表达PRRSV N蛋白的重组腺病毒,其具有良好的免疫原性,为建立针对PRRSV抗体的间接ELISA检测方法和进一步研发PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。 相似文献
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【目的】构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列(登录号:MH898990.1)合成PoRV VP4基因,将得到的目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行重组,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-VP4;腺病毒穿梭载体经过Pme Ⅰ内切酶线性化处理后与含有腺病毒骨架pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAd-VP4,对重组质粒进行Pac Ⅰ酶切鉴定,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将重组质粒转染HEK293A细胞获得重组腺病毒rAd-VP4,对该重组腺病毒进行扩大培养并测定重组腺病毒的半数组织培养感染剂量(TCID50);通过RT-PCR检测其体外表达情况,Western blotting检测其反应原性;将制备的重组腺病毒用不同病毒滴度和不同免疫次数对小鼠进行腹腔免疫,收集血清通过ELISA法测定IgG抗体水平。【结果】RT-PCR扩增出1条大小为2 343 bp的rAd-VP4重组腺病毒条带,测序结果正确,表明重组腺病毒rAd-VP4构建成功,测得rAd-VP4病毒滴度为106.5 TCID50,Western blotting结果表明,重组腺病毒rAd-VP4在蛋白水平上得到了正确表达,蛋白的分子质量约为87 ku。小鼠IgG抗体检测结果表明,在用106.5 TCID50 rAd-VP4免疫后的第35和42天,小鼠血清中的IgG抗体水平显著高于105.3 TCID50 TGE-PED-PRV三联活疫苗IgG抗体水平(P<0.05);106.5 TCID50 rAd-VP4在免疫后第35和42天产生的抗体水平显著高于105.5和104.5 TCID50 rAd-VP4(P<0.05),而105.5 TCID50 rAd-VP4在免疫后第28天产生的抗体水平显著高于106.5和104.5 TCID50 rAd-VP4(P<0.05)。106.5 TCID50 rAd-VP4的2次免疫和3次免疫产生的IgG抗体在不同免疫时间均差异不显著(P>0.05)。【结论】本研究成功构建了重组腺病毒rAd-VP4,其病毒滴度为106.5 TCID50。106.5和105.5 TCID50 rAd-VP4分别在第42和28天产生较高的IgG抗体水平,2次免疫和3次免疫对产生IgG抗体水平均无显著影响。试验结果可为开发PoRV重组腺病毒候选疫苗提供参考。 相似文献
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旨在调查野鸟中存在的禽流感病毒,并为禽流感的防制提供依据。采集新疆艾比湖自然保护区野鸟的粪便棉拭子进行禽流感病毒的分离与鉴定,将PCR产物进行纯化后用T载体连接并转化到DH5α细胞中;菌液PCR鉴定后将目的菌液送至上海生工测序并比对测序结果,在NCBI上进行基因序列分析。结果显示,从新疆艾比湖自然保护区野鸟的粪便棉拭子分离得到1株H1N2亚型禽流感病毒;经序列分析得知,该毒株为1株低致病性禽流感病毒,且存在与多种亚型病毒的重配现象。 相似文献
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2014年5、8和10月分别对渤海西部滨海带陆域海河、马颊河、黄河COD_(Mn)和TOC进行测定,分析各河流中COD_(Mn)与TOC的浓度变化趋势,并开展二者相关性研究。结果表明,海河、马颊河和黄河COD_(Mn)浓度范围分别为2.87~20.25、5.83~14.44、1.80~4.80 mg/L,TOC浓度范围分别为4.26~9.51、5.05~26.62、3.00~16.27 mg/L,其中马颊河有机污染最重,黄河最轻;在海河和马颊河中的两种污染物浓度从上游到下游均呈升高趋势,但在黄河中的变化不大。海河和黄河COD_(Mn)和TOC浓度均值受采样时间变化的影响很小,而马颊河中TOC浓度均值在5月和10月有显著差异。三条河流各月份的COD_(Mn)和TOC的相关性差异较大,COD_(Mn)和TOC协同变化趋势越相似,相关性越显著。 相似文献