BBTV两个株系DNA组分1的克隆及序列分析

 对在生物学特性特别是寄主范围上存在明显差异的NSP株系和NS株系的代表分离物(广州天河分离物和高州分离物)的DNA组分1进行了克隆和序列分析,结果表明:2个代表分离物的DNA组分1全序列、ORF及其编码的氨基酸序列的变异率分别为3.2%、3.1%和2.8%,从而进一步确证了可以用寄主范围来作上述2个株系的鉴定。此外,这2个株系的DNA组分1、ORF及其编码的氨基酸序列分别与肖火根等报道的中国(广东)分离物、以及亚洲组和南太平洋组各分离物进行比较,结果表明:NS株系与肖火根等报道的中国(广东)分离物的亲缘关系很密切;这2个株系与亚洲组各分离物的差异均较小,而与南太平洋组各分离物的差异均较大,它们应属亚洲组。     

溶菌酶基因合成及其原核表达

根据T4噬菌体溶菌酶的氨基酸序列,选用植物偏爱的密码子设计并人工合成了溶菌酶基因,并在N-端加上23个氨基酸残基的α-淀粉酶信号肽序列和信号肽酶切位点HQP;用苷氨酸残基替代C-端的酰胺;新基因全长为576 bp,共编码190个氨基酸.为了检测该基因生物活性,将其克隆到原核表达载体pET28b( )中,导入宿主细菌E. coli BL21(DE3) pLysS,经IPTG诱导后,宿主细菌在2 h内全部被溶菌酶基因的表达产物裂解,说明该溶菌酶基因对细菌具有很强的抗性.     

中国台湾番茄曲叶病毒侵染引起广东番茄黄化曲叶病

广东汕头番茄(Lycopersicon eseulentum)上发生的黄化曲叶病毒病,田间症状表现为病株明显矮化、病叶褪绿黄化、叶小且卷曲和叶质较脆硬。对该病毒代表分离物(BS)基因组DNA-A克隆和测定结果表明,其全长为2740nt(GenBank acces-sion No.DQ237918),具有菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒基因组典型特征,为闭合环状单链DNA,有6个ORFs,分别位于病毒链上的AV1、AV2及位于互补链上的AC1、AC2、AC3和AC4;在基因AV2与AC1之间有269nt的非编码区。BLAST结果显示,BSDNA-A与Begomovirus中来自亚洲的病毒同源性较高,而与美洲、非洲等地的相对较低;其中与中国台湾番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus,ToLCTWV)DNA-A全序列同源性最高,为97.7%,而二者的AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4基因及IR的同源性分别为98.6%、98.0%、98.0%、97.5%、96.3%、98.6%和96.6%,推导编码的6个蛋白的氨基酸序列同源性分别为97.7%、99.1%、97.5%、95.6%、91.8%和99.0%%。全序列系统进化关系树显示,BS与ToLCTWV的亲缘关系最近,并形成一个独立分支,再与广东番茄曲叶病毒G2(Tomato leaf curl Guangdong virus G2,ToLCGDV-[G2]和广东番茄曲叶病毒G3(Tomato leaf curl Guangdong virus G3,ToLCGDV-[G3]形成一个大的分支,而与其它33种Begomovirus病毒的亲缘关系均相对较远。这些结果表明,BS应是ToLCTWV的一个分离物。     

广东黄瓜棒孢叶斑病（褐斑病）的发生及品种抗病性鉴定

黄瓜（Cueumissativus）是广东省主要蔬菜作物之一,年种植面积15万hm^2以上。由半知菌亚门棒孢属（Corynespora）多主棒孢霉（Corynesporacassiicola）侵染引起的黄瓜棒孢叶斑病又称为褐斑病、靶斑病,是近年来黄瓜生产上重要病害之一（杨双娟等,2012）,目前已在山东、河北、北京、辽宁、吉林、河南、云南、海南、宁夏、甘肃和上海等11个省（市、区）发生为害,春秋种植的黄瓜发病比较严重,病害发生率达到30％以上（高苇,2011）。2011年,笔者在广东首次发现黄瓜棒孢叶斑病的危害。     

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染广东辣椒的病毒种类

【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主要种植区采集疑似病毒病辣椒样品125份,分别提取每份辣椒病样总RNA,对从茂名、梅州、韶关3市采集的病样按地点和症状混合成7份混合病样进行小RNA深度测序分析,根据小RNA深度测序分析结果,对每种病毒分别根据小RNA深度测序拼接的基因片段序列和GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计2对特异性引物,以小RNA深度测序的病样RNA为模板进行RT-PCR扩增,根据扩增效果对引物进行筛选,进一步应用筛选出的引物,对采集于广东省的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,根据检测结果明确危害广东辣椒的病毒种类。【结果】从采集于广东省8市的辣椒主要种植区的125份病样中检测到14种病毒,按照检出率从高到低依次为辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMoV）(44.0%）、甜椒内源RNA病毒（Bell pepper endornavirus,BPEV）（32.8%）、烟草轻型绿花叶病毒（Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）（31.2%）、辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）（29.6%）、辣椒黄脉病毒1（Pepper vein yellow virus 1,PeVYV-1）（26.4%）、甜椒斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）（25.6%）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）（18.4%）、辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）（16.8%）、辣椒黄脉病毒6（Pepper vein yellow virus 6,PeVYV-6）（16.8%）、马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y,PVY）（15.2%）、辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus,CaCV）（14.4%）、蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV-2）（9.6%）、辣椒隐症病毒1（Pepper cryptic virus 1,PCV1）（8.8%）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）（4.0%）。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上,但PMMoV、ChiVMV和PVMV分布广泛,PMMoV除了茂名外,ChiVMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVMV广泛分布于8市辣椒产区,根据检出率和分布范围,得出PMMoV、ChiVMV和PVMV是危害广东辣椒的优势病毒。同时发现,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍,在本研究125份病样中病毒复合侵染率达到88.0%,其中2种、3种、4种、5种、6种、7种和8种病毒复合侵染检出率分别为28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%,由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。【结论】危害广东辣椒的病毒有14种,其中PMMoV、ChiVMV和PVMV为优势病毒,且复合侵染普遍,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。     

侵染广东辣椒的辣椒脉斑驳病毒的分子特征

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）是引起广东辣椒病毒病的主要病原之一,为了明确侵染为害广东辣椒的ChiVMV分子特征,采用分段RT-PCR和RACE扩增方法克隆了ChiVMV广东分离物（ChiVMV-GD）的基因组全序列,结果表明,除poly（A）尾外,ChiVMV-GD基因组大小为9 721 nt,编码一个大小350.44 kD多聚蛋白（位于167 ~ 9 436 nt）,5′–非编码区（5′-UTR）和3′–非编码区（3′-UTR）分别含有166和285 nt,5′–末端结合病毒基因组连接蛋白（VPg）,3′–末端含有poly（A）尾。序列同源性分析结果表明：ChiVMV-GD与ChiVMV其他分离物的基因组序列同源率为79.1% ~ 96.9%,其中与来自中国海南分离物（登录号：GQ981316.1）的同源率最高（96.9%）。系统进化分析结果显示,ChiVMV-GD与海南分离物聚集在一个小分支,说明与海南分离物亲缘关系最近。     

广东南瓜细菌性叶枯病及其病原鉴定

 在广东省雷州市发生一种南瓜(Cucurbita moschata)叶枯病,病株叶片边缘开始出现水渍状病斑,逐步发展成大病斑,后期病斑焦枯;在叶片上也可形成近圆形水渍状病斑,伴有黄色晕圈,后期病斑联合形成不规则大枯斑;叶柄和匍匐茎被侵染后呈水渍状腐烂。从病斑上分离到一种细菌,在KB培养基上,菌落为椭圆形,乳白色,半透明,边缘参差不齐,紫外灯照射下产生荧光反应。致病性测定结果表明,该病原细菌可侵染6个南瓜品种引起与田间症状相同的叶枯病。生理生化试验结果表明,该病原细菌与丁香假单胞丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)的特性一致。应用假单胞菌属特异引物Ps-for/Ps-rev和丁香假单胞丁香致病变种组群特异性引物Group III-F/Group III-R,可从该病原细菌中扩增出预期大小分别为1 018 bp和750 bp的目的片段。应用丁香致病变种syrB基因特异性引物B1/B2,可从该病原菌中扩增出预期大小为750 bp的丁香霉素基因片段。基于16S rDNA与gyrB基因序列系统进化分析均表明,南瓜叶枯病菌株与已报道的P. syringae pv. syringae菌株HS191(CP006256)亲缘关系最近,二者聚类在一起形成一个小分支。人工接种条件下,该病原细菌还可侵染西葫芦、丝瓜、茄子、番茄、菜豆、扁豆等植物。这些结果表明,引起广东省南瓜叶枯病的病原为丁香假单胞丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)。这是首次在中国发现丁香假单胞丁香致病变种引起南瓜叶枯病。     

广东番茄曲叶病毒G3分离物基因组DNA-A的分子特征

 从采集于广东花都的番茄曲叶病病株上分离到病毒分离物ToLCGDV-[G3],序列分析结果表明,其DNA-A为单链环状,全长2744 nt,共有6个ORFs,其中病毒链上编码AV1(CP)、AV2,互补链上编码AC1、AC2、AC3和AC4。BLAST结果显示,与ToLCGDV-[G3]基因组有同源关系的均属双生病毒科菜豆金色花叶病毒属。进一步比较结果表明,ToLCGDV-[G3]与有同源性的菜豆金色花叶病毒属病毒的DNA-A全序列同源率最高为87.9%。其中IR的同源率为59.0%~85.3%,而AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4这6个ORFs同源率分别为73.6%~95.2%、64.0%~95.4%、71.7%~87.7%、69.6%~93.9%、67.7%~95.1%和64.1%~94.2%,它们各自编码的氨基酸序列同源率分别为76.3%~99.2%、52.6%~95.7%、69.7%~88.1%、51.9%~88.9%、63.4%~92.5%和33.0%~90.7%。系统进化关系分析结果显示,ToLCGDV-[G3]与ToLCGDV-[G2]亲缘关系最近,二者组成一个独立的分支,与其它40种菜豆金色花叶病毒属病毒的亲缘关系均较远。因此,ToLCGDV-[G3]可能是一个先前未报道的双生病毒科菜豆金色花叶病毒属新种。     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征 及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。