柑橘溃疡病的发生及其综合防控

柑橘溃疡病是一种为害全世界柑橘种植业最严重的细菌性病害[1],并列入国内外检疫性病害。该病主要分布于亚洲、非洲、美洲、大洋洲及马来群岛的一些国家和地区。在我     

柑橘溃疡病菌的普通LAMP及快速LAMP检测方法的建立

建立柑橘溃疡病菌的普通LAMP和快速LAMP检测方法,使其能应用于基层检验检疫部门对病害的快速检测.利用柑橘溃疡病菌基因组特有的保守区域设计LAMP引物,通过优化反应条件,建立柑橘溃疡病菌的普通LAMP检测体系;在普通LAMP引物的基础上设计一对环引物,建立柑橘溃疡病菌的快速LAMP检测体系,并以多种参比菌DNA以及健康柑橘叶片基因组DNA为模板对普通LAMP和快速LAMP检测体系的特异性进行了验证,利用柑橘溃疡病菌菌液和DNA溶液梯度稀释液对普通LAMP和快速LAMP检测体系的灵敏度进行了验证.普通LAMP检测体系菌体和DNA检测灵敏度分别达到了2.25×104 cfu和2.03×10-1 ng,快速LAMP检测体系菌体和DNA检测灵敏度分别达到了2.25 cfu和2.03×10-5ng.在特异性测试中,普通LAMP检测体系与快速LAMP检测体系均仅对柑橘溃疡病菌进行扩增,对非靶标菌和柑橘叶片基因组DNA不产生扩增,普通LAMP与快速LAMP检测体系特异性测试结果一致.快速LAMP检测体系在0.5h内就可以达到普通LAMP检测体系的扩增量,是普通LAMP检测体系反应时间的一半,大大提高了检测的效率;快速LAMP检测体系菌悬液和DNA检测灵敏度均比普通LAMP检测体系提高了10 000倍.成功地建立了柑橘溃疡病菌的普通LAMP及快速LAMP检测方法,为柑橘溃疡病菌的检测提供了一种新的简便、快速的检测手段.     

柑橘溃疡病菌快速诊断胶体金速测卡的研制

将制备并提纯的抗Xcc单克隆抗体、多克隆抗体及重组抗体,采用间接ELISA方法对比其效价和特异性,筛选用于胶体金速测卡的最优抗体;采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗Xcc单抗Xcc-2D8,固定于金标垫上;利用双抗夹心原理,将单抗Xcc-2D6和羊抗鼠抗体分别固定于硝酸纤维素膜上,作为检测线(T线)和质控线 (C线),经试验条件优化,组装胶体金速测卡密封干燥保存.对Xcc菌悬液及柑橘样本浸泡液进行检查.结果表明ELISA方法筛选出2株特异性强、稳定性好的抗体(Xcc-2D8效价为1∶128 000倍、Xcc-2D6效价为1∶256 000倍),应用于胶体金速测卡的研发;所研制速测卡对Xcc菌悬液的最低检测下限为1×103～1×104 cfu/mL,对多个地区的206份柑橘样本进行实际检测所得结果与qPCR方法所得结果具有较高一致性(kappa值=95.15％),混杂的柑橘组织液对检测结果无影响,检测时间控制在10 min以内,检测常见细菌及植物病菌显示特异性良好,各批次速测卡无批间差异,速测卡保存方便稳定性良好.     

柑橘溃疡病菌单链二硫键稳定重组抗体的构建、表达和特性

柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease,CBCD)是危害柑橘(Citrus reticulata Blanco)的重要病害,为了给柑橘溃疡病的现场快速诊断提供一种稳定的重组抗体,构建一种快速检测技术,本研究以鼠源抗柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)表面脂多糖的二硫键稳定性抗体dsFv为模板进行基因改造,利用重叠延伸PCR在其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间引入一条人类抗体重链恒定区1(CH1)5'端12个氨基酸的序列作为连接肽,构建重组单链二硫键稳定抗体基因sc-dsFv。将获得的基因连接pET24a(+)载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。表达产物经体外复性并以Ni-NTA亲和层析对目标蛋白sc-dsFv进行纯化,利用斑点免疫杂交、ELISA和BIAcore检测抗体的活性、稳定性、特异性及亲和力。构建的抗体基因经测序结果表明,抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因之间成功引入目标连接肽序列,重组sc-dsFv蛋白实现了原核高效表达;通过体...