黄瓜高频再生体系的建立

【目的】建立黄瓜的高频再生体系,为黄瓜种质的遗传转化奠定基础。【方法】分别以华北型黄瓜种质26号、欧洲型黄瓜种质14-1为材料,研究不同激素组合、AgNO3质量浓度、苗龄、子叶切割方式及外植体接种方式对黄瓜子叶节不定芽诱导的影响。【结果】华北型黄瓜种质26号再生的最适激素组合为4.0mg/L 6-BA+0.3mg/L IAA+1.0mg/L AgNO3,再生率与再生系数分别可达85.00%和2.51;欧洲型黄瓜种质14-1再生的最适激素组合为3.0mg/L 6-BA+2.0mg/L ABA+1.0mg/L AgNO3,再生率与再生系数分别可达86.70%和2.77;5d苗龄的黄瓜子叶作为外植体时诱导不定芽的状态最佳;切除子叶端部2/3且基部附带有1mm子叶柄、以叶背向下子叶柄微插入的方式进行接种再生效率最高。【结论】建立了黄瓜种质14-1和26号材料的高频再生体系,再生率均可达85%以上。     

黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 的原核表达载体 的构建及表达分析

以先前克隆到的黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 全长的cDNA 为模板,用含有特异性酶切位点
的Yh1、Yh2 为引物,通过PCR 方法将黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 的ORF 区构建到大肠杆菌表达载体
pGEX-4T-1 上获得原核表达载体p4t-LOX2,将该表达载体p4t-LOX2 转化到大肠杆菌菌株BL21（DE3）
中,获得相应的重组工程菌。在IPTG 诱导下,通过SDS-PAGE 电泳,得到一条约115 kD 的融合蛋白条带,
除去pGEX-4T-1 自身诱导的约26 kD 大小的GST 标签蛋白后,CsLOX2 编码一个约89 kD 的蛋白。 经过
融合蛋白表达体系的优化分析,表明该融合蛋白在 37℃,0.80 mmol·L^-1 IPTG 诱导表达 10.5 h,可获得
融合蛋白的最大表达量。     

利用Gateway技术构建黄瓜HPL基因的RNA干扰载体

为探讨黄瓜脂氢过氧化物裂解酶基因(HPL)下调表达对黄瓜果实挥发性醛类物质合成的影响,设计1对特异引物,以黄瓜pDONR201 HPL质粒为模板,通过PCR扩增出323 bp的片段。利用基于同源重组原理的Gateway技术,将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR201中。对扩增出的323 bp的片段进行测序,测序结果显示该序列与原序列同源性为100%。在此基础上,通过LR反应将目的片段插入过表达的植物RNA干涉载体pHellsgate8,构建黄瓜HPL基因的RNAi表达载体pHellsgate8 HPLi,分别经限制性内切酶XhoⅠ、XbaⅠ酶切后获得323 bp的片段,与预期结果一致。采用热击法将pHellsgate8 HPLi转化农杆菌GV3101,经菌液PCR扩增获得323 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pHellsgate8 HPLi已成功转入农杆菌中。     

黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2的克隆及表达分析

【目的】以华北型黄瓜种质26号为材料克隆黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2的cDNA全长并分析其序列特征,在此基础上研究该基因在果实发育进程中的表达模式、酶活性变化及相应的C6醛类物质含量,为研究脂氧合酶基因在黄瓜果实醛类香气物质形成中的作用机制奠定基础。【方法】以华北型黄瓜种质26号为材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆黄瓜的脂氧合酶基因CsLOX2的cDNA全长并分析其生物信息学特征,对CsLOX2在果实发育进程中的表达模式进行Real-time PCR检测,通过气质联用（GC-MS）技术测定相应的C6醛类香气物质的含量并利用分光光度法测定LOX酶活性。【结果】华北型黄瓜种质26号的CsLOX2基因cDNA全长2 878 bp,ORF区为2 640 bp,编码879个氨基酸,推导的蛋白质分子量为99.39 kD,等电点为6.28。通过氨基酸序列比对发现,该基因编码的氨基酸序列具有脂氧合酶家族的3个重要特征区域及植物LOX中皆具有的6个高度保守的组氨酸,该序列与其它物种的脂氧合酶氨基酸序列具有较高的同源性。根据其N端序列特征推测CsLOX2属于I类LOX,具有13-LOX活性。Real time-PCR分析结果表明,该基因在花后3 d表达量最高,此后下降,至花后15 d最低;脂氧合酶的活性自开花当天逐渐上升,至花后12 d达到最高,此后下降;C6醛类香气含量在果实发育始期较高,随果实发育进程逐渐下降,至花后12 d最低。【结论】利用RACE技术克隆了华北型黄瓜种质26号脂氧合酶基因CsLOX2的cDNA全长,序列分析表明该基因具有植物LOXs的特征结构域。CsLOX2基因表达高峰先于脂氧合酶活性高峰的出现,C6醛类香气含量在果实发育始期较高,随果实发育进程逐渐下降。该研究结果将为进一步探讨脂氧合酶基因在黄瓜果实醛类香气物质形成中的作用机制奠定基础。     

黄瓜嫩果果皮颜色的遗传研究

黄瓜嫩果果皮颜色是最重要的商品性状之一,在当前育种目标转向多样化和专用化的过程中引起了人们越来越多的关注。本研究以嫩果果皮颜色不同的3份黄瓜(Cucumis sativus L.)品系为亲本,分别配制2个杂交组合Q16(深绿色)×Q8(黄白色)及Q16×Q24(黄白色),构建6个世代遗传群体,通过目测与色差仪相结合的方法对6个世代各单株的黄瓜嫩果果皮颜色性状进行观察和分级处理,并应用植物数量性状主基因+多基因模型进行世代联合分析,研究了黄瓜嫩果果皮颜色的遗传规律。结果表明,Q16×Q8和Q16×Q24两个杂交组合中,嫩果果皮颜色性状的分离群体世代呈现单峰或双峰偏态分布,这表明该性状为数量性状且有主基因控制。遗传分析表明,两杂交组合中黄瓜嫩果果色遗传都符合2对主基因的加性-显性-上位性遗传模型(B-1模型);说明黄瓜嫩果果皮颜色性状由2对主基因控制,在两组合中,其主基因遗传力在F2群体中最高,分别为87.4%和93.1%,另外,两对主基因在两个组合中的加性效应近似相等,分别为1.368、-0.132和1.451、-0.049,两组合中两对主基因的显性效应分别为0.625、1.625和0.529、1.530,两对主基因中第一对主基因加性效应明显,而第二对主基因显性效应明显。两个组合主效基因表现的遗传力较高,表明在杂交育种中对黄瓜嫩果皮色可以进行早代选择。本研究结果为黄瓜嫩果果皮颜色性状的基因定位和新种质创制提供了理论依据。