条件性敲除D1133L基因的重组非洲猪瘟病毒的构建及增殖特性

前期研究初步表明非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L基因对ASFV复制至关重要,本研究拟进一步探究D1133L在ASFV复制中的作用。利用同源重组技术结合大肠杆菌lac阻遏操作系统实现条件性敲除D1133L基因,以pUC118为骨架重组转移载体ASFVΔi130,将重组转移载体转染骨髓源巨噬细胞(BMDMs),以ASFV CN/GS/2018为亲本毒株感染BMDM,在β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在的条件下,经绿色荧光和PCR鉴定,获得条件性敲除D1133L重组毒株vD1133Li。利用荧光显微镜观察该重组毒株与亲本毒株在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中的复制差异,利用qPCR技术比较重组病毒与亲本毒株的复制差异,分析vD1133Li在无IPTG情况下回补D1133L蛋白后与在IPTG诱导情况下的复制差异。结果显示：本研究成功构建了条件性敲除D1133L的ASFV重组病毒vD1133Li,重组毒株不表达D1133L,在IPTG诱导下复制能力显著低于亲本毒株;在稳定表达D1133L的MA-104细胞系中,vD1133Li复制能力恢复。综上所述,D1133L基因对于ASFV复制至关重...     

过表达非洲猪瘟病毒D1133L蛋白的MA-104细胞系建立及其初步应用

旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever, ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞系,分析ASFV在MA-104/D1133L细胞系与MA-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染MA-104/D1133L细胞后p30和p72基因的转录和蛋白表达水平,同时测定病毒滴度和病毒拷贝数评价ASFV的复制能力。结果表明：ASFV p30和p72基因在MA-104/D1133L细胞系的转录和蛋白表达水平高于野生型细胞系,ASFV在MA-104/D1133L细胞系的病毒增殖能力高于野生型细胞。本研究成功构建了过表达ASFV D1133L基因的MA-104/D1133L细胞系,与野生型细胞相比,D1133L能促进ASFV增殖,MA-104/D1133L细胞系更利于ASFV的复制,本结果为进一步研究ASFV D1133L基因功能积累了生物材料。