猪单精注射胚与孤雌胚激活后的发育

用猪的冷冻精液,以不同的激活方法进行猪单精注射(ICSI)胚胎的生产.结果表明,联合应用电激活和化学激活所获ICSI胚卵裂率(79.28%)明显高于单纯电激活组卵裂率(58.77%),但两组桑囊胚发育率无统计学差异(31.58%对22.67%),电化学联合激活较单纯的电激活更有利于ICSI胚胎的发育.通过比较孤雌电激活胚与ICSI胚胎的发育情况,发现孤雌激活胚与ICSI胚在卵裂率、桑囊胚发育率上均无显著差异,表明现有实验电激活参数完全适用于猪ICSI胚胎的体外生产.     

猪卵泡闭锁过程中颗粒细胞凋亡和Fas/FasL变化

为了揭示猪卵巢卵泡选择性闭锁机制,采用Real time PCR和HE染色方法,检测猪各阶段卵泡颗粒细胞中Fas和FasLmRNA表达和形态学变化;分析比较不同发育阶段卵泡中颗粒细胞Fas和FasLmRNA表达差异及细胞凋亡程度。结果表明,健康的大(5 mm)、中(3～5 mm)、小(3 mm)卵泡,早期闭锁的大、中、小卵泡以及晚期闭锁的大、中、小卵泡壁层颗粒细胞都有Fas和FasLmRNA表达。早期闭锁卵泡颗粒细胞Fas和FasLmRNA相对表达量高于健康卵泡与晚期闭锁卵泡。早期闭锁小卵泡FasLmRNA相对表达量与大、中、小健康卵泡相比均有显著差异(P0.05);状态相同的大、中、小卵泡间Fas与FasLmRNA相对表达量均无显著差异(P0.05);表明Fas/FasL系统在猪卵巢卵泡选择性闭锁过程中,对颗粒细胞凋亡具有重要的调节作用。     

猪卵母细胞第1极体与核相对位置变化对去核率的影响

为探讨猪受体卵母细胞体外成熟过程中第1极体(pbⅠ)与细胞核相对位置的动态变化规律及其对去核效率的影响,准确判定受体卵母细胞去核"窗口期"提供试验依据。将体外采集的GV(Germinal vesicle)期卵母细胞随机分为3组,分别成熟培养42～44 h、44～46 h、46～48 h,并采用Hoechst33342荧光染色法对成熟过程中pbⅠ与细胞核相对位置进行检测判定。结果显示,随着体外成熟时间的延长,卵母细胞的成熟率呈逐渐增加的趋势,但pbⅠ与细胞核的位置发生偏离的比率逐渐增加,而去核率则表现为逐渐降低的趋势,pbⅠ偏离率与去核率之间呈现一定程度的负相关;体外成熟44～46 h,既能获得较高的卵母细胞成熟率(80.2%),又可以保证理想的去核率(81.2%)。说明延长体外成熟时间所造成的去核率显著降低与pbⅠ发生偏离有关,体外成熟44～46 h是该试验条件下猪受体卵母细胞去核的最佳"窗口期"。     

猪体细胞克隆胚胎的体外生产试验

 【目的】通过优化猪体细胞核移植程序,建立获得克隆囊胚的有效方法。【方法】比较不同电激活参数、不同体外培养条件对猪体细胞克隆胚发育能力的影响。【结果】选用1.5 kV?cm-1、80 μs 和1 DC的参数组合,对猪核移植重构胚进行电融合和电激活,可获得较高的卵裂率和最高的囊胚发育率（分别为71.4%和14.3%）,且囊胚发育率显著高于其它组（P＜0.05）;0.4% BSA NCSU 23 培养液培养克隆重构胚72 h,半量换液并未改善克隆胚的发育,但添加10% FBS 可显著提高囊胚发育率（15.1%对10.3%,P＜0.05）和DNA 完整率(56.8%对46.6%,P＜0.05) ;采用猪卵泡颗粒细胞（pGC）共培养体系未能显著提高克隆胚发育率（P＞0.05）,但卵丘细胞（pCC）单层共培养时,囊胚发育率显著高于对照组（16.7%对9.8%,P＜0.05）,培养5 d 的克隆胚凋亡率也显著低于对照组（39.5%对54.2%,P＜0.05）。【结论】采用1.5 kV?cm-1、80 μs 和1 DC 的参数组合对猪克隆重构胚进行电融合和电激活,以0.4% BSA NCSU 23培养液作 pCC 单层共培养72 h,然后换用10% FBS NCSU 23 培养液,可明显提高囊胚发育率。     

小鼠-猪种间体细胞克隆试验

用3代~5代小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)作核供体细胞,体外成熟培养44 h~46 h、排出第1极体(PbI)的猪卵母细胞去核后,进行小鼠-猪种间核移植操作。Hoechst 33342染色检查去核效果,去核率为84.2%(27/32)。共培养68枚小鼠-猪种间核移植重构胚,其中48枚发生卵裂,卵裂率为70.6%,13枚胚胎发育至8-细胞,发育率达27.1%(13/48)。     

猪体细胞克隆胚胎体外发育过程中的凋亡规律

本试验旨在研究比较猪体细胞克隆胚胎体外发育与凋亡变化规律,探讨其体外发育潜能与细胞凋亡间的关系。将体外成熟培养获得的猪MⅡ期卵母细胞随机分为2组,分别进行体细胞核移植(SNCT)与体外受精(IVF)处理,采用彗星试验(Comet assay)和Real-time RT-PCR技术对体外发育过程中各时期胚胎的细胞凋亡事件及抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达水平进行研究。结果表明,两组在卵裂率上无显著差异(77.6%vs 80.3%,P0.05),在囊胚发育率上,SCNT组胚胎明显低于IVF组,但无统计学差异(18.9%vs 24.5%,P0.05);随着胚胎发育,SCNT与IVF组胚胎的凋亡率均呈现不断增加的趋势,Bcl-2 mRNA表达量则逐渐下降;到16-细胞以后,SCNT组胚胎的凋亡率均显著高于IVF组,同时Bcl-2 mRNA表达量均显著低于IVF组(P0.05)。本试验结果表明,猪克隆胚胎生产效率低下可能与胚胎发育过程中的细胞凋亡有关。