抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体制备及部分特性鉴定

以原核表达系统pGEX-6p-1-N/BL21经IPTG诱导表达的重组PEDV N-GST融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,制备单克隆抗体,用原核表达系统T12-pPROHTa/BL21经IPTG诱导表达的PEDV N蛋白做筛选抗原,通过间接ELISA进行筛选,获得两株抗PEDV N蛋白杂交瘤细胞,命名为2E3、4C6。亚类鉴定为IgG1和IgG2a型,均为к链抗体,染色体数平均为(91±7)对。用制备的单抗与pGEX-6p-1-N/BL21、T12-pPROHTa/BL21诱导表达后的菌体裂解物做Western Blot试验,在不同载体表达的N蛋白处出现明显的特异性条带;通过间接ELISA做病原检测,这两株单抗不与TGEV、PRV和PrV发生交叉反应,而与PEDV显示良好的特异性反应。     

猪流行性腹泻病毒LJB/03地方株核蛋白基因序列分析及其原核表达

以猪腹泻粪便样品提取RNA,应用RT-PCR方法扩增获得了PEDV地方株LJB/03核衣壳蛋白(N)全基因序列,测序结果表明:N基因全长1326 bp,编码441个氨基酸,包含405个腺嘌呤(30．5%)、329个鸟嘌呤(24．8%)、294个胞嘧啶(22．2%)和298个胸腺嘧啶(22．5%)。与已发表的序列相比,LJB/03株N基因和其他分离株核苷酸的同源性在95%以上,与JS2004、chinju99、Brl/ 87、CV777同源性分别是97．4%、95．6%、96．6%、96．8%;氨基酸同源性在96．5%以上,与JS2004、chinju99、Br1/87、CV777的同源性分别是98．0%、96．90%、96．1%、96．4%。序列分析表明:N蛋白包含7个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点、9个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和2个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点。将N基因定向克隆到原核表达载体pGEX- 6p-1,转化宿主菌BL21中,经IPTG诱导后,N基因得以表达。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,确定表达的融合蛋白大小约为75ku,且具有良好的反应原性。