利用CRISPR/Cas9n系统编辑绵羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因

成纤维细胞生长因子5(FGF5)是影响毛囊周期性活动及毛发生长的重要生长因子。本研究利用CRISPR/Cas9n系统靶向编辑绵羊成纤维细胞中FGF5基因。首先利用Gibson Assembly法将U6启动子引导表达单导向RNA(sgRNA)的原件构建至pX461质粒中,获得pX461-U6质粒;再将设计并合成好的1对靶向FGF5基因第3外显子的sgRNA及其互补链,经退火连接形成sgRNA-sg1和sgRNA-sg2双链后,分别克隆至带有BbsⅠ和BsaⅠ黏性末端的pX461-U6质粒。构建好的重组质粒pX461-U6-sg1+sg2经测序鉴定后,以电转染的方式转入绵羊成纤维细胞,72 h后收集细胞进行检测分析。经T7E1酶切检测分析表明,成功获得1对具有靶向效果的sgRNA,PCR扩增的FGF5基因片段经TA克隆后进行测序鉴定,结果sgRNA-sg1+sg2在靶位点的打靶效率为100%;缺失的核苷酸数从10到64个不等;基于预测的3D模型和RT-PCR结果显示,FGF5基因的突变将会影响FGF5蛋白与其受体的结合,导致FGF5蛋白失去其生物学功能。本研究构建了可以在同一载体中同时表达2条sgRNA和Cas9n以及绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,瞬时转染至绵羊成纤维细胞后,成功获得了高效靶向绵羊FGF5基因的sgRNA位点,为精确和高效的靶向基因工程提供了科学依据。     

新疆部分地区梅迪维斯纳病毒感染的血清学调查

旨在了解新疆地区梅迪维斯纳病的流行现状和特点，本研究于2017—2019年从新疆阿克苏、阿勒泰、巴州、昌吉、哈密、石河子和伊宁收集2 647份羊血清样品，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行梅迪维斯纳病抗体检测，对不同地区、品种、性别来源绵羊的梅迪维斯纳病抗体阳性率进行统计分析。结果显示，阿克苏、阿勒泰、巴州、昌吉、哈密、石河子和伊宁梅迪维斯纳病抗体阳性率分别为28.95%（121/418）、0.67%（5/751）、2.50%（2/80）、4.91%（8/163）、1.14%（3/264）、1.22%（1/82）和17.10%（152/889）；其中，阿勒泰羊、和田羊、哈萨克羊、美利奴羊、萨福克羊、小尾寒羊的梅迪维斯纳病抗体阳性率分别为0.35%（1/288）、1.14%（3/264）、22.87%（231/1 010）、13.86%（42/303）、1.85%（13/702）和2.50%（2/80）；新疆本土品种羊与引进品种羊血清梅迪维斯纳病抗体阳性率分别为0.79%（8/1 015）、1.58%（15/947）；公羊与母羊梅迪维斯纳病抗体阳性率分别为3.59%（34/946）、15.17%（258/1 701）。本研究结果分析表明，需要对梅迪维斯纳病进行早期检疫，及时发现并淘汰病羊，改善饲养管理条件，这对促进羊产业健康发展具有重要意义。     

绵羊胚胎FGF5基因单碱基突变体系的建立

研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊（Ovis aries）成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor 5，FGF5）基因第1外显子以引入终止密码子，获得定点编辑类型的绵羊胚胎，为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA （single guide RNA，sgRNA）寡核苷酸链（sgRNA-T1~sgRNA-T4），构建4组不同的重组表达载体；将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞，随后用Cruiser^TM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示，sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被Cruiser^TM酶酶切，且测序结果表明都具有靶向效果，编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中，并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率，结果显示，胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max （ng/μL）∶sgRNA （ng/μL）=100∶50，从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示，引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子，通过在成纤维细胞转染表达载体，成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA （T1、T4）；通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎，成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变，为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。     

利用单碱基编辑系统定点编辑哈萨克羊MSTN基因的研究

肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）可负调控骨骼肌的发育。本研究利用胞嘧啶碱基编辑器（cytidine base editor,CBE）在哈萨克羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子,以期达到敲除MSTN基因的目的。共设计2条靶向哈萨克羊MSTN基因不同外显子的sgRNAs,分别连接至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒,并与pCMV-AncBE4 max-P2A-GFP质粒共转染哈萨克羊胎儿成纤维细胞,经Cruiser^TM酶酶切检测、Sanger测序和TA克隆分析。结果显示,成功筛选出可以在哈萨克羊MSTN基因外显子提前引入终止密码子的2条sgRNAs,其中STOPsg-1靶位点编辑效率为26.7%,STOPsg-2靶位点的编辑效率为6.7%。本研究成功运用CBE（AncBE4 max）技术在哈萨克羊胎儿成纤维细胞MSTN基因编码区实现定点编辑,为培育精确编辑MSTN基因的哈萨克羊奠定基础。     

miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响

【目的】研究miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响。【方法】采用Percoll密度梯度离心法获得纯化绵羊精子，将绵羊卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在培养箱中培养16~18 h获得成熟卵母细胞，从1月龄纯种萨福克绵羊耳组织分离成纤维细胞，通过实时荧光定量PCR比较绵羊精子、成熟卵母细胞与成纤维细胞中miR-449b的相对表达量；给成熟卵母细胞分别显微注射0.9 %生理盐水（Con组）、miR-449b模拟物对照（NC mimic）与miR-449b模拟物（miR-449b mimic），注射后进行孤雌激活，分别于激活的第2、7天统计胚胎卵裂率与囊胚率；将成熟卵母细胞进行体外受精（IVF），收集IVF、Con、NC mimic与miR-449b mimic组2-细胞胚胎，采用免疫荧光法比较组蛋白H3K9me3的变化。【结果】miR-449b在精子中的表达显著高于成熟卵母细胞和成纤维细胞（P＜0.05）；与Con组相比，miR-449b mimic和NC mimic组胚胎的卵裂率均显著降低（P＜0.05），NC mimic组胚胎卵裂率显著低于miR-449b mimic组（P＜0，05）；miR-449b mimic组胚胎囊胚率提高，但差异不显著（P＞0.05）；IVF、Con、NC mimic与miR-449b mimic组2-细胞胚胎均表达组蛋白H3K9me3，且都在细胞核表达。与Con组相比，NC mimic组2-细胞胚胎组蛋白H3K9me3的表达水平显著增加（P＜0.05），miR-449b mimic组显著降低（P＜0.05）；NC mimic组2-细胞胚胎组蛋白H3K9me3的表达水平显著高于miR-449b mimic组（P<0.05），miR-449b mimic与IVF组无显著差异（P＞0.05）。【结论】miR-449b能显著提高绵羊早期胚胎的发育率，且降低早期胚胎中H3K9me3的表达水平。