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为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后合成并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Opti-E2;转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经SDS-PAGE和Western blot分析,成功获得大小为43 kDa的BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好。本试验E2蛋白的成功表达可为后续ELISA方法的建立和亚单位疫苗的开发奠定基础。 相似文献
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B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的结构蛋白,也是病毒的保护性抗原,可以刺激机体产生强烈的抗病毒反应。为表达出高可溶性的B2L蛋白并检测其免疫原性,将羊口疮病毒B2L基因进行密码子偏爱性优化设计,并截取抗原性高、疏水性好的区域,构建了His-tag融合可溶性标签的表达重组载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,经IPTG诱导,利用SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的His融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA agarose亲和纯化后,进行Western-blot验证。结果显示,经过SDS-PAGE和Western-blot鉴定的目的条带分子质量与预期大小相符。本试验成功在上清中表达和纯化出B2L基因编码蛋白。 相似文献
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为了解内蒙古呼和浩特部分地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况,本研究采用RTPCR技术从采集自内蒙古某屠宰场的32份牛肺脏样品中检测出两株BVDV,命名为BVDV-HT1704、BVDV-HT1723株。通过在MDBK细胞上传代、免疫荧光试验、5’-UTR基因序列测定及分子进化分析对检测出BVDV阳性的肺脏组织进行鉴定。结果显示:在MDBK细胞中盲传10代后没有病变产生;经IFA检测,在病毒感染的细胞浆内产生特异性荧光;序列同源性和系统进化分析表明该毒株属于BVDV-Ⅱa型,且两株分离株属于单一的分支。本研究首次在我国正常牛肺脏组织中分离到BVDV,为了解BVDV在内蒙古自治区的流行情况及地理分布提供依据,并为相关疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
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为比较羊口疮病毒(ORFV)强弱毒株毒力相关基因序列,将分离自山东省某发病羊场的强毒株ORFV/QD/2015,在山羊皮肤成纤维细胞上连续传90代,然后将ORFV/QD/2015强毒株和传90代后毒株的质粒测序结果与已经公布的9组ORFV全基因序列中的ORF020、ORF112、ORF117、ORF127基因进行比对。结果显示:ORFV/QD/2015强毒株与公布毒株毒力相关基因的同源性高,而传90代毒株与其同源性有所降低。将强毒株与传90代毒株4组毒力相关基因的核苷酸进行比对,发现其基因编码氨基酸均发生了多处变异,其中ORF020发生了7处,ORF112发生了52处,ORF117发生了14处,ORF127发生了15处。比对后发现,核苷酸与编码氨基酸变异最多的为ORF112基因,最少的为ORF020基因。两毒株间的抗原指数也有明显变异。研究认为,ORFV毒力相关基因的变异可能与其毒力有很大联系,这个变化可能与传代过程中基因发生多处变异有关,也可能是这些毒力基因共同作用的结果。 相似文献
5.
为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测序鉴定正确后,将p SVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒,收集病变细胞上清,并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA(SVA-WT)分别感染BHK-21细胞,以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照,感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体(MAb) 5D10 (1∶1 000)、鼠源Strep-tag II MAb (1∶2 000)作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠Ig G (1∶2 000)为二抗,采用间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒鉴定。IFA结果显示,以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗,SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光,以Strep-tag II MAb作为一抗时,仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光,经SVA-WT感染的BHK-2... 相似文献
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