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H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引:3,自引:1,他引:2
通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,并制作标准曲线,建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为13.68,18.21和20.57;变异系数分别为0.31%、0.17%和0.12%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度. 相似文献
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根据GenBank公布的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白羧基端序列(AF290001.1),设计合成2对特异性引物,采取套式PCR方法,以肺炎支原体培养物中提取的DNA为模板,扩增肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,将其克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a/P1(3 802~4 695),转化大肠埃希菌BL21-gold,测序验证后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE表明重组蛋白表观分子质量与预期一致,可溶性表达产物经Western blot证实重组蛋白具有免疫反应性。 相似文献
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为建立鉴别致病性结核杆菌感染和卡介苗接种产生的IgG抗体,分别用结核杆菌的混合抗原TB1、TB2和PPD包被,以结核病患者血清为阳性对照,以PPD试验阴性健康人血清作为阴性对照,建立了TB1-ELISA、TB2-ELISA、PPD-ELISA三种检测结核杆菌抗体的方法。20份阳性标本检测结果显示,TB1-ELISA、TB2-ELISA、PPD-ELISA的阳性检出率分别为45%、50%、95%,100份健康人血清标本检测结果显示,TB1-ELISA、TB2-ELISA、PPD-ELISA的符合率为93%、90%、68%。研究工作为研发致病性结核杆菌感染IgG抗体检测试剂奠定了一定基础。 相似文献
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为获得HDAg抗原,以含有ORF5编码区基因的pETHD质粒为模板进行PCR扩增得到500bp大小片段,经过BamHⅠ、HindⅢ双酶切,与载体pET-30a连接,构建重组表达质粒pET-30a/HDAg,再转入细胞BL21(DE3),经过IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,表达蛋白分子质量约27ku,经过Ni-NTA亲和层析纯化后,纯度达95%以上。将纯化的蛋白经HRP标记,初步建立ELISA捕获法,通过对24份标本检测和交叉反应试验,结果表明表达的抗原具有很好的反应原性和特异性,为建立丁型肝炎早期检测试剂盒提供材料。 相似文献
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建立一种快速检测人血清中程序性细胞死亡因子5(PDCD 5)的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,初步研究PDCD 5蛋白在血清中含量变化与疾病的相关性。用抗PDCD 5多克隆抗体包被酶标板,高碘酸钠法标记PDCD 5单克隆抗体作为酶标抗体,以PDCD 5重组蛋白为标准蛋白绘制标准曲线,以特异性、稳定性和灵敏度对ELISA方法进行评价。检测81份癌症患者及21份类风湿性关节炎患者血清,探讨血清PDCD 5蛋白与癌症、免疫缺陷病的相关性。经双扩散试验检测标记后的抗体和酶都具有生物学活性,初步建立了检测人血清PDCD 5蛋白的定量ELISA方法,该方法具有良好的特异性、稳定性,灵敏度达0.5ng/mL。临床检测应用表明,类风湿性关节炎患者血清PDCD 5含量明显高于正常人血清,癌症患者血清PDCD 5蛋白水平明显低于正常人含量(P<0.05),各种癌症患者之间PDCD 5含量差异不显著(P>0.05)。成功建立了一种检测人血清PDCD5的定量ELISA方法,为疾病的诊断提供临床参考。 相似文献