鸟苷酸结合蛋白GBP1和GBP2抑制猪轮状病毒体外复制

本研究旨在探究鸟苷酸结合蛋白1(guanylate-binding protein-1,GBP1)、鸟苷酸结合蛋白2(guanylate-binding protein-2,GBP2)的全长、片段、GTPase酶活性对猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)复制的影响。以猪肾细胞cDNA和GBP1、GBP2质粒为模板,PCR扩增出GBP1、GBP2基因的全长和截断体(G、M、E、ME区),克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体上。在恒河猴细胞(MA104)细胞上过表达或沉默GBP1、GBP2基因,探究对PoRV复制的影响。设置不同的时间点,筛选GBP1、GBP2对PoRV复制产生影响作用的时间点。应用泛GTPase酶抑制剂(CID-1067700)探究GBP1、GBP2的GTPase酶活性对PoRV的作用。通过免疫印迹法Western blot、荧光定量PCR、病毒毒价测定等方法检测GBP1、GBP2蛋白的表达情况,并研究其抗病毒功能。结果表明：成功构建pCDNA3.1(+)-GBP1-HIS和pCDNA3.1(+)-GBP2(47aa-592aa)、(131aa...     

猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用

根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的核酸进行扩增,均无PCV3目的条带出现;随机抽取扩增的16份临床病猪样品目的条带进行TA克隆后测序,结果显示均为PCV3特异性目的片段,16株PCV3江苏毒株扩增序列与已报道的PCV3/US/SD2016和PCV3/CN/Hubei-618基因序列同源性分别为98.4%~99.6%、99.0%~99.8%,而16个毒株之间的同源性为98.3%~100%。利用所建立的PCR方法检测了2014~2017年间收集的江苏省临床病猪样品938份、健康猪样品500份,PCV3的阳性检出率分别为6.93%和0.6%;其中,2014年病猪样品中的阳性率为1.92%,后呈逐渐上升的趋势,2017年达到12.67%。本研究表明,建立的PCR方法特异、敏感,可以用于临床PCV3的检测;PCV3在江苏省猪群2014年已有感染,并呈逐年升高的趋势,应予以重视。     

耐热Taq DNA聚合酶的酸酐修饰及其在降低PCR非特异性扩增中的应用评价

酸酐能与聚合酶上的赖氨酸结合形成聚合物,试验通过选用合适的酸酐,修饰Taq DNA聚合酶。在常温下,酶活性被封闭,升温过程中不表现酶活,从而减少非特异性扩增和引物二聚体的形成;而在较高的温度下一段时间后,一般为94℃、15 min,酸酐脱落,聚合酶得以恢复正常的扩增活性,从而实现PCR反应的热启动。由此建立的热启动PCR体系灵敏度高,可以检测到10个拷贝的DNA分子,较普通PCR体系提高了2个数量级。此方法较其他方法操作简单成本低廉,且所得的热启动Taq DNA聚合酶稳定性好,便于保存,其灵敏性与特异性也更高。这种通过化学修饰形成的复合物达到热启动PCR目的的方法的建立,具有着重要的意义,是提高PCR灵敏度和特异性的重要方法之一。     

猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果：将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。     

猪A群轮状病毒VP6单克隆抗体的制备和初步鉴定

旨在通过RT-PCR扩增猪A群轮状病毒(group A rotavirus, RVA)VP6基因节段，并克隆至pET28a-SUMO,构建原核表达载体pET28a-SUMO-VP6,将该重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱亲和层析纯化以获得重组蛋白SUMO-VP6,Western blot验证该重组蛋白能够与小鼠抗轮状病毒血清反应。将该重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，Western blot和间接免疫荧光验证阳性杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与RVA的反应性。经3轮亚克隆最终获得一株能稳定分泌针对VP6蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株5G9,其分泌的单抗亚类为IgG1,轻链类型为Kappa,制备的小鼠腹水效价可达1∶4 096 000,能够与不同基因型的RVA反应，同时不与常见的猪腹泻相关病毒反应，为未来猪RVA相关基础研究、临床血清学检测方法的开发奠定了基础。     

非洲绿猴FILIP1L真核表达质粒的构建及其抑制PEDV复制的研究

为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响，以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增出FILIP1L基因，克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因，通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况，并研究其抗病毒功能。结果：成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒，转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后，FILIP1L基因的mRNA表达显著上调；过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制；下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上，FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制，研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。