以免疫纳米微球为凝集原的犬细小病毒2型抗体凝集检测方法的建立

为建立以红色聚苯乙烯纳米微球为载体的犬细小病毒(CPV)抗体检测的间接凝集方法,本研究表达纯化了CPV-2VP2截短的重组蛋白rsVP2,并以rsVP2为致敏原与纳米微球偶联制备了免疫彩色纳米微球;通过对反应条件的优化,建立了一种快速检测CPV-2抗体的间接凝集方法。特异性试验结果显示,致敏微球仅与CPV-2阳性血清发生凝集反应,不与犬瘟热病毒、狂犬病病毒和犬腺病毒的阳性血清发生凝聚反应,特异性强;该凝集方法检测血清中和抗体的最低效价为1∶256;同一批次制备的3份致敏微球、3个不同批次制备的致敏微球以及4℃保存90d的致敏微球与CPV-2阳性血清的凝集反应特异性一致,凝集程度无明显差异,重复性稳定性均较好。该间接凝集检测方法对40份血清样品的检测结果与ImmunoComb■ Canine VacciCheck试剂盒(Dot-ELISA)检测结果的阳性符合率为97%。本研究建立的间接凝集方法为幼犬CPV-2母源抗体或免疫犬CPV-2抗体检测提供了一种快速、简便、准确、经济的方法。     

大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种可以同时扩增大肠杆菌(E.coli)F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因保守序列的多重PCR检测方法,本研究设计合成5对分别针对F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的特异性引物,以具有相应菌毛基因的E.coli参考菌株DNA为模板,通过对多重PCR反应条件的优化,建立了检测F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的多重PCR方法。所建立的多重PCR方法能够特异性扩增F4、F5、F6、F41、F18菌毛基因的目的片段,大小分别为770 bp、533 bp、422 bp、643 bp和1140 bp,该方法对沙门氏菌、猪丹毒杆菌、巴氏杆菌以及无菌毛基因的E.coli等参考菌株均无特异性扩增片段,检出F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的最低活菌浓度分别为5.3×10^5cfu/mL、3.7×10^6cfu/mL、3.1×10^5cfu/mL、3.7×10^7cfu/mL、6.9×10^5cfu/mL。用不同批次的引物和试剂进行3次多重PCR检测均能扩增出目的条带,表明建立的多重PCR方法有很好的批内和批间重复性。对90株大肠杆菌临床分离菌株菌毛基因进行检测,F4阳性率为3.33%,F5阳性率为2.22%,未检测到F6、F41和F18阳性菌株,其检测结果与常规单一PCR的检测结果一致。研究表明:建立的E.coli菌毛基因多重PCR分型方法具有很好的特异性、敏感性和重复性,可用于E.coli分离菌株菌毛基因型的快速鉴定,同时提高了检测效率。