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为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫是一种重要的寄生于鸡盲肠细胞内的寄生原虫,可引起危害严重的鸡球虫病。目前,对鸡球虫病的预防和治疗主要依靠抗球虫药,而药物的广泛使用使球虫产生了严重的耐药性。为研究球虫耐药性产生的机制,本实验室前期对诱导的地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株和亲本敏感株进行转录组测序,经分析发现TCP-1亚基α为耐药株和敏感株的差异表达基因且在耐药株上调表达。本文以柔嫩艾美耳球虫敏感株为模板,成功克隆出TCP-1亚基α基因,构建了原核表达重组质粒p ET-Et TCP-1α,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TCP-1α,用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔和BALB/C小鼠获得多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法检测柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株TCP-1亚基α基因的m RNA转录和翻译水平,同时检测了该基因在球虫不同发育阶段的转录水平和翻译水平。结果显示,Et TCP-1α在2个耐药株的m RNA转录和蛋白翻译水平明显高于敏感株,而且该蛋白在第二代裂殖子的表达最高;间接免疫荧光实验显示该蛋白主要位于子孢子和第二代裂殖子表面,当虫体入侵DF-1细胞进行裂殖生殖后,该蛋白分布于整个虫体,且表达量明显升高。因此,推测Et TCP-1α在柔嫩艾美耳球虫细胞内的生长发育和耐药性的产生过程中发挥了一定的作用。 相似文献
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在前期实验中,本实验室利用i TRAQ技术研究了柔嫩艾美耳球虫子孢子感染宿主细胞后蛋白质组学的变化,获得了一批与子孢子入侵相关的宿主蛋白。本研究以鸡肌肉的c DNA为模板,对其中活化蛋白激酶C受体1(receptor for activated C kinase1,RACK1)进行克隆、表达及纯化,结果显示,成功获得RACK1-GST融合蛋白,并作为免疫原制备兔抗RACK1-GST多克隆抗体;利用RT-q PCR和Western blot检测子孢子感染DF-1细胞过程中RACK1的m RNA转录水平和蛋白表达水平。结果显示,子孢子感染细胞24~72 h时,细胞RACK1的转录水平和蛋白表达水平均明显提高;利用抗体抑制入侵试验检测RACK1多抗对子孢子入侵细胞的影响,结果显示,100μg/m L和200μg/m L RACK1-GST抗体作用细胞后对子孢子的入侵影响不大,而300μg/m L和400μg/m L作用细胞后能明显促进子孢子的入侵。以上结果表明,宿主RACK1对球虫子孢子入侵细胞起负调控的作用,但具体机制尚需深入研究。 相似文献
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