棉花抗枯萎病相关GhB301基因对烟草的遗传转化及功能分析

[目的]ERF是乙烯信号传导途径中的重要转录因子,在植物与病原菌互作中发挥着重要的调控作用.棉花抗枯萎病相关GhB301基因是从棉花中获得的ERF-B3亚组基因,探索该基因在烟草异位表达后的功能,为进一步研究其在棉花抗枯萎病中的功能奠定基础.[方法]以pPZP35S表达载体为基础,构建GhB301的过表达载体;采用农杆菌介导法转化烟草并获得转基因植株.[结果]经卡那霉素筛选、PCR和RT-PCR检测,获得3株转基因阳性植株;qPCR分析显示,转基因阳性植株中部分病程相关蛋白基因的表达量较野生型明显升高.[结论]棉花抗枯萎病相关基因GhB301在烟草中异位表达后可能会通过增强部分病程相关蛋白基因的表达来提高植株抗病性.     

转GhB301基因棉花响应枯萎病菌侵染的转录组分析

乙烯响应因子(ethylene responsive factor, ERF)可以激活或者抑制下游病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用。为探究ERF-B3亚组基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子调控机制,本研究利用已获得的转GhB301基因棉花株系,通过孢子悬浮液蘸根的方法对转GhB301基因棉花株系(N)和野生型对照(WT)进行接菌处理,抗病性鉴定结果表明,过表达GhB301的N株系增强了对枯萎病的抗病性,其病情指数为14.77,显著低于WT(病情指数为37.50);枯萎病菌侵染0、6、12、24、48 h后,利用RNA-seq技术对N和WT的根部组织进行测序分析,共得到273 111 170个clean reads,其Q30均大于87.64%,将clean reads与陆地棉参考基因组TM-1比对,获得了14 021个差异表达基因(DEGs)。与WT相比,转基因株系能够在病原菌侵染后更快速地做出响应。GO及KEGG富集分析发现共有135个DEGs参与氧化还原过程,67个DEGs参与防御反应,31个DEGs参与苯丙烷类生物合成,推测这些DEGs可能与转基因棉花的枯萎病抗性增强存在密切关系。本研究结果为阐明GhB301基因响应棉花枯萎病菌侵染规律奠定了基础。     

棉花抗枯萎病相关转录因子基因GhERFB101的克隆与表达分析

为了探究ERF转录因子家族与棉花枯萎病抗性之间的关系,也为海岛抗枯萎病品种的选育工作提供新的基因资源,从Solexa高通量测序技术建立的棉花基因表达谱中筛选探针序列,通过电子克隆结合RT-PCR技术从高抗枯萎病的棉花品种中棉所12中克隆到一个新的ERF-B1亚组转录因子基因,命名为Gh ERFB101(Gen Bank:KF850521)。序列分析表明,该基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域,在进化上与拟南芥At ERF11的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,枯萎病菌诱导后,Gh ERFB101基因在抗病品种根中的表达量呈现下降趋势;而在感病品种中,该基因呈上调表达,随着病菌处理后时间延长,其表达量呈现先增加后降低的变化趋势,在病菌处理后12 h表达量达到最大,在48 h下降到最低。乙烯和茉莉酸诱导后,该基因表达量均呈现明显的先增加后降低的变化趋势,在乙烯处理后2 h基因的表达量达到最大;茉莉酸则在处理后1 h基因的表达量达到最大;而水杨酸诱导后基因的变化幅度不大;推测该基因可能通过茉莉酸、乙烯信号传导途径参与对枯萎病菌的防御反应。     

枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析

选用陆地棉抗枯萎病品种中棉所12和感枯萎病品种新陆早7号,利用Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗受到枯萎病菌侵染后3 h和6 h根部组织的基因表达谱。中棉所12受病菌侵染后3 h与0 h相比,6 h与0 h相比以及6 h与3 h相比,分别鉴定出4447、5481和2559个差异表达基因;新陆早7号分别鉴定出8615、6727和2078个差异表达基因;2个品种比较,在3 h和6 h分别鉴定出1879个和500个差异表达基因。基因功能分析表明,差异表达基因划分为生物学过程、细胞组分和分子功能注释本体,并进一步细分为48个功能类别。代谢通路分析显示,中棉所12和新陆早7号在枯萎病菌侵染后的6 h与0 h相比鉴定出的代谢通路(Pathway)最多,均有126条;在枯萎病菌侵染后6 h,2个品种相比鉴定出的代谢通路最少,仅有89条。各个比对组的代谢通路涉及的基因可被划分为次生代谢产物的生物合成、多糖的生物合成和代谢、环境适应和免疫系统等13类。在环境适应和免疫系统分类中存在着植物与病原菌相互作用代谢通路,涉及到996个已知功能的差异表达基因,有444个基因上调表达,552个基因下调表达。其中,差异表达基因最多的是WRKY转录因子家族基因,其次为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,而DNA损伤修复/耐受性蛋白,JAZ1、RAR1和RPM1互作蛋白,S位点的特异性糖蛋白S6前体以及钙牵引蛋白等6类基因参与该代谢通路的数目最少。最后随机抽取6个基因进行实时荧光定量PCR验证,其结果与测序结果一致。     

枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的转录因子表达变化

以陆地棉抗病品种中棉所12和感病品种新陆早7号为材料,利用Solexa高通量测序技术调查枯萎病菌诱导后不同时间感、抗陆地棉品种转录因子家族及转录因子的表达情况。结果表明,枯萎病菌诱导后,抗病品种中棉所12有39个转录因子家族的433个转录因子在至少一个比对组中表达活性发生变化;感病品种新陆早7号则有52个转录因子家族的588个转录因子在至少一个比对组中表达活性发生变化。新陆早7号对枯萎病菌响应的转录因子及转录因子家族的数目明显多于中棉所12,且2个品种的下调基因数目均多于上调基因。随着枯萎病菌诱导后时间延长,两品种对枯萎病菌诱导响应的转录因子家族及转录因子数量均呈现先增加后降低的变化趋势,中棉所12在枯萎病菌诱导后6 h达最多,而新陆早7号在诱导后3 h达最多。在6个比对组中,表达活性均发生变化的重叠转录因子,中棉所12中有9个,隶属于6个转录因子家族;新陆早7号中有31个,隶属于17个转录因子家族。不同抗病性品种对枯萎病的响应有较强的品种特异性,除37个共有的转录因子家族外,2个转录因子家族是中棉所12所特有,15个转录因子家族是新陆早7号所特有。     

应用Solexa测序技术分析棉花不同抗病品种的数字表达谱

棉花枯萎病是一种危害严重的世界性病害,构建棉花枯萎病不同抗病品种的基因表达谱将为进一步研究棉花抗枯萎病的分子调控机制及筛选抗枯萎病相关基因奠定基础.本研究选用高抗枯萎病的陆地棉品种中棉所12和高感枯萎病的陆地棉品种新陆早7号为材料,利用Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗根部组织中的基因表达情况.Solexa高通量测序后构建了多达350万个reads的标签文库,根据已知序列信息,显著差异表达基因1 080个,其中上调基因302个,下调基因778个.基因功能分析表明,已注释的显著差异表达基因可划分为分子功能、生物过程和细胞组件3个功能注释本体,并进一步细分为37个功能类别.鉴定出112条代谢通路,注释了1 238个显著差异表达基因,共涉及氨基酸代谢、多糖的生物合成和代谢、脂类代谢、能量代谢及信号转导等方面.在植物激素信号转导通路分析中,涉及到26个已知功能基因,4个基因编码AP2/ERF转录因子,4个基因与LRR类受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶或蛋白激酶有关,5个基因与蛋白磷酸酶2C有关,而这些基因都参与植物的抗病反应.随机抽取5个基因进行实时荧光定量PCR验证,其结果与测序结果一致.本研究初步揭示了棉花枯萎病抗感品种在转录组水平上的表达差异,获得了大量差异表达基因.     

GhWRKY44基因在烟草中遗传转化及功能分析

为了进一步验证GhWRKY44(登录号:KJ801807)基因在烟草异位表达后的功能,构建了Ca MV35S启动子调控、Nos为终止子的棉花抗枯萎病相关基因(GhWRKY44)的过表达载体;电击法将其导入农杆菌GV3101,菌液PCR筛选鉴定阳性菌株,采用农杆菌介导法转化烟草;T0转化植株经卡那霉素筛选、PCR检测后,随机从转基因T0中选取5株进行RT-PCR检测,均为阳性株,说明GhWRKY44基因不仅整合到烟草基因组中而且还能正常转录。对过表达GhWRKY44基因的转基因烟草T1株系进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。结果表明,在正常生长情况下,PR5和NPR1的表达量在转GhWRKY44株系中明显增加,枯萎病菌侵染后,在转GhWRKY44株系中,PR1a、PR2和NPR1的表达量迅速增加,明显高于野生型株系,而PR5的表达量则低于野生型株系,说明该目的基因能在烟草中异位表达并能激活病程相关蛋白基因的表达,但其功能仍需进一步研究。