感染大肠杆菌F17湖羊羔羊脾脏中差异circRNA分析

【背景】羊大肠杆菌病是一种以剧烈腹泻和败血症为特征的急性传染病,是规模化羊场最为常见高发的细菌性疾病之一,尤其是初生羔羊易被产肠毒素大肠杆菌（ETEC）感染,引起羔羊腹泻,又叫羔羊白痢,使养殖场遭受严重的经济损失。而传统的抗生素治疗方案存在诸多缺陷。【目的】 本研究通过让湖羊羔羊口服大肠杆菌 F17菌株获得不腹泻和腹泻的羔羊个体,筛选出服用大肠杆菌F17菌毛后不腹泻与腹泻型个体中差异表达的circRNA,进而探究circRNA在绵羊抗腹泻中的作用,从而发现与抗大肠杆菌病性状相关的候选基因。从circRNA层面上,加深对绵羊拮抗大肠杆菌F17菌株的认识,确定绵羊拮抗大肠杆菌F17菌株的功能基因。【方法】用CIRI软件从头预测circRNA,利用RNA-seq技术,首次筛选出感染大肠杆菌F17菌株后不腹泻与腹泻型羔羊个体脾脏中差异表达的(DE)circRNA,对差异表达转录本进行GO富集分析,结合GO注释结果对其功能进行描述。统计每个GO条目中所包括的差异转录本个数,并用Fisher's exact test计算每个GO条目中差异转录本富集的显著性。然后随机选择6个DE circRNA,利用q-PCR分别验证这6个DE circRNA在不腹泻和腹泻组羔羊脾脏内的相对表达水平,进而利用Miranda软件来预测与miRNA结合的circRNA以及miRNA的靶基因,根据miRNA靶基因的功能注释来阐明此部分circRNA的功能,分析circRNA-miRNA-mRNA相互作用,最后用q-PCR验证circRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平。【结果】 绘制参考序列后,鉴定出已知的7 730个circRNA,DE circRNA与GO 数据库进行比对,发现一共有60条circRNA被注释和分类到297个功能亚类中。利用RNA-seq在不腹泻和腹泻羔羊脾脏中筛选出60个差异表达的(DE) circRNA,其中31个上调和29个下调,用q-PCR验证随机选择的6个DE circRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平,发现与RNA-seq结果一致。利用Miranda分析circRNA-miRNA-mRNA相互作用,发现6个circRNA、5个miRNA和8个mRNA之间存在一定的靶标关系,用q-PCR验证mRNA在不腹泻组和腹泻组羔羊体内的相对表达水平,发现与RNA-seq结果一致。【结论】 探究了对于不腹泻和腹泻羔羊脾脏中circRNA的表达谱,进一步了解其在绵羊抗病发生过程中的调控作用。发现了不腹泻和腹泻羔羊脾脏中差异表达的circRNA,有助于找出羔羊如何抵抗腹泻的发生机制,为羔羊抵抗腹泻提供科学的依据。     

F17大肠埃希菌黏附湖羊小肠上皮细胞模型的初步建立

为探究F17大肠埃希菌对湖羊小肠上皮细胞的黏附机制,以体外培养的小肠上皮细胞和F17大肠埃希菌为研究对象,根据黏附后培养过夜的菌落数,调整黏附时间与感染复数(MOI),获取最佳黏附条件,初步建立F17大肠埃希菌黏附小肠上皮细胞的细胞模型;利用实时荧光定量PCR分别检测F17大肠埃希菌黏附后及脂多糖(LPS)诱导后的白细胞介素(IL)-6、IL-8和IL-1β的表达情况来鉴定该模型。结果表明:F17大肠埃希菌黏附3 h与黏附1、2、4 h时,黏附MOI=100∶1与MOI=200∶1、400∶1、500∶1差异显著,即F17大肠埃希菌黏附MOI=100∶1、黏附时间3 h为最佳黏附条件;小肠上皮细胞免疫相关基因的表达量随黏附时间、诱导时间发生显著变化;与LPS诱导模型相比, F17大肠埃希菌黏附模型更能模拟细菌黏附细胞的生理状态,说明模型建立成功。