禽腺病毒4型人工感染SPF鸡动态病理学观察

为了深入研究禽腺病毒4型的致病机理,以34日龄SPF鸡人工感染禽腺病毒4型建立了禽腺病毒感染病理模型,并在感染后第1~10天剖杀试验鸡,采集胸腺、心、肝、腺胃、脾、肾,采用常规病理学方法和免疫组织化学方法研究其在感染SPF鸡体内的动态病理变化规律。结果表明,34日龄SPF鸡经口服途径感染禽腺病毒4型,成功建立了人工感染动物模型。感染后第3天鸡出现临床症状,第4~6天为死亡高峰期,第7天后病鸡开始恢复,发病率75%,死亡率67.8%。攻毒后第5天病鸡肝脏病变最重,病变肝细胞内可见嗜碱性、嗜酸性的包涵体,免疫组织化学染色可见攻毒后第5天鸡的肝细胞、脾脏网状细胞和肾小管上皮细胞中出现棕黄色阳性颗粒。     

Ⅳ型禽腺病毒Fiber-2(knob)蛋白的表达及免疫效力评价

表达Ⅰ群Ⅳ型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-2 (knob)蛋白,以制备Fiber-2 (knob)蛋白亚单位疫苗并对其免疫效力进行评价.将FAdV-4 Fiber-2的knob基因克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Fiber-2 (knob).将重组质粒转化至大肠杆菌BL-21 (DE3)...     

H3N2亚型犬流感病毒实验感染模型的建立

【目的】建立H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)实验感染模型，了解犬流感的发病特征，为疫苗效力评价奠定基础。【方法】6—13月龄CIV血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)抗体阴性(HI<1:10)比格犬26只，其中3只鼻腔喷雾PBS作为阴性对照，另23只分5组(10、10³、10⁵、10⁶、10⁷ EID₅₀/只)，分别为3、5、5、5、5只/组，每只犬各鼻腔喷雾H3N2亚型CIV(A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2)，简称HB株)病毒液1mL。观察临床症状、肺脏病变和肺脏组织病理学变化，计算肺实变率，检测病毒和HI抗体效价。【结果】10 EID₅₀剂量感染组，3只犬均未出现明显临床症状，肺脏均无明显眼观病变，肺脏实变率0%，无组织病理学变化，病毒检测均为阴性，HI抗体效价几何平均值(geometric mean titer,GM...     

鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）母源抗体的消长规律

【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体的效力,制定疫苗的最小免疫日龄。【方法】随机采集鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）二免后135日樱桃谷种鸭的种蛋孵化,随机取5、7、10和15日龄免疫种鸭后裔雏鸭10只和相对应日龄非免疫种鸭后裔雏鸭5只,采血,分离血清,测定母源抗体,并以0.1mL/羽（含100DID₅₀）的剂量经腿部肌肉攻毒。观察雏鸭攻毒后的临床表现（采食量、粪便、精神和死亡情况）,观察至攻毒后10d。攻毒后2d经颈静脉采血,分离血清进行病毒分离。每份血清接种5枚6日龄SPF鸡胚,0.1mL/枚,37℃孵化,24h以内死亡鸡胚视为非特异死亡,孵化至168h。只要有1枚及以上鸡胚死亡则判该鸭感染。计算母源抗体雏鸭组的攻毒保护率和无母源抗体组的发病率。攻毒后5d,分别称量雏鸭的体重,计算平均日增重。对成对样本进行T检验,分析母源抗体对雏鸭增重的影响。通过试验鸭中和抗体、增重变化和病毒分离的方法评价母源抗体的效力。【结果】（1）1日龄雏鸭的母源抗体阳性率最高,1、5、7、10和15日龄雏鸭的母源抗体阳性率分别为56.1%（37/66）、40%（4/10）、50%（5/10）、30%（3/10）和0%（0/10）,5-7日龄抗体阳性率处于平台期,15日龄时母源抗体降低至全阴性;（2）攻毒后对照鸭表现精神沉郁（20/20）、仰翻和侧翻等神经症状（6/20）及死亡（2/20）,有母源抗体的雏鸭临床症状明显轻于对照组。（3）5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重115.5、142.8、177.8和162.2g。5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重54.5、91.0、165.0和118.8g。（4）5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭的攻毒保护率分别为50%（5/10）、60%（6/10）、20%（2/10）和0%（0/10）; 5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭的发病率均为100%。（5）5和7日龄雏鸭平均增重和攻毒保护率最高,分别为50%（5/10）和60%（6/10）,10和15日龄雏鸭的母源抗体尽管低（20%和0%）或阴性,仍然有明显的保护作用。【结论】（1）鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体能够保护10日龄内雏鸭;（2）疫苗首次免疫的时间以7-10日龄为最佳。     

一株H3N8亚型马流感病毒的鉴定及HA基因序列分析

2016年4月北京某马场出现马流感疑似疫情,为确诊病原,从发病马群中采集鼻拭子接种鸡胚分离病毒,并进行血凝试验和血凝抑制试验、基因测序和BLAST比对分析。结果表明,从鼻拭子中分离到1株马流感病毒,命名为A/equine/Beijing/2016。血凝试验、血凝抑制试验及测序结果表明,该分离株为H3N8亚型。对分离株的HA基因进行遗传进化分析,表明该分离株属于H3N8亚型美洲谱系的佛罗里达Ⅱ群。对该分离株及国内近年来的马流感病毒分离株的HA氨基酸序列进行分析,发现该分离株相比于OIE推荐的疫苗候选株出现了一个重要的抗原漂移。马流感病毒HA基因的不断变异,提示有必要加强对国内马流感病毒的流行病学监测。     

H3亚型犬流感病毒的荧光定量PCR方法建立及其增殖特性研究

旨在建立H3亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)荧光定量PCR方法,利用该方法对病毒在犬肾细胞(MDCK细胞)上增殖特性进行研究.根据CIV的血凝素(HA)片段上的HA2基因保守区设计并合成特异性引物,构建CIV-HA重组质粒作为标准品,经过条件优化,建立H3亚型CIV荧光定量检测方法...     

鸽副黏病毒灭活疫苗候选株aYQ的生物学特性研究

评价鸽副黏病毒(PPMV)致弱毒株aYQ的生物学特性,为研制鸽副黏病毒灭活疫苗奠定基础。将PPMV aYQ株经SPF鸡胚连续传代,建立种子批。测定各代次毒种的血凝效价(HA)和鸡胚半数感染量(EID50),并进行纯净性检验;测定毒种鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT)、1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI);测定毒种对鸡胚和鸽的毒力、遗传稳定性和抗原相关性。PPMV aYQ株经SPF鸡胚传代至F10,HA效价为1∶256～1∶512,病毒含量为10-8.5 EID50/0.1mL～10-8.9 EID50/0.1mL,毒种各代次均无细菌、霉菌、支原体以及外源病毒污染;PPMV aYQ株的ICPI和IVPI结果均为0,MDT测定结果大于120h;以103倍稀释的PPMV aYQ株病毒液接种10日龄SPF鸡胚96h无死亡,无眼观病变。以106EID50/羽的剂量人工感染鸽,未见异常症状;PPMV aYQ株各代次F基因均未发生基因突变,F蛋白裂解位点氨基酸序列均为-112GRQGRL 117-;交叉血凝抑制试验和交叉中和试验结果表明,PPMV aYQ株与NDV La Sota株间存在明显的抗原性差异。鸽副黏病毒弱毒株aYQ能够在SPF鸡胚上稳定传代,且生物学特性稳定,免疫原性良好,可以作为鸽源副黏病毒灭活疫苗的毒种。     

鸭坦布苏病毒病卵巢病变标准的判定

【目的】了解产蛋鸭感染鸭坦布苏病毒后卵巢病变产生的进程和卵巢病变规律,为采用产蛋鸭卵巢病理变化检查法进行疫苗效力检验提供依据。【方法】70只260日龄产蛋樱桃谷鸭,以0.5mL/只（含100DID50）的剂量经胸部肌肉接种鸭坦布苏病毒（HB株）强毒。观察试验鸭的临床症状,统计每日产蛋数和采食量。攻毒后2 d,每只鸭经翅静脉采血,分离血清,经卵黄囊途径接种5枚6日龄SPF鸡胚,每胚0.1mL。接种后置37℃条件下继续孵化,24 h死亡鸡胚弃去。采用RT-PCR方法测定24-72 h死亡鸡胚的DTMUV核酸,将1/5或以上鸡胚死亡且DTMUV核酸阳性的鸭判为DTMUV感染鸭。攻毒后4-10 d,每日剖杀10只鸭,观察和分析生殖系统病变。统计病变率,检查输卵管内是否有蛋,卵泡是否变形、出血和破裂,依据病变率和病变,确定检查内容和病变卵巢的判定时间和标准。【结果】（1）攻毒后3、4、5、6 d,鸭几乎不采食,产蛋数明显下降。攻毒后7 d,鸭精神状况好转;攻毒后8 d,采食量开始回升。（2）70只鸭中,除1只鸭的病毒分离结果为阴性外,其余69只鸭的病毒分离结果均为阳性,病毒分离阳性率为98.6%（69/70）。（3）攻毒后4-10 d,共64只产蛋期鸭的生殖器官可以判定。（4）攻毒后4、5、6、7、8、9和10 d,卵巢病变率分别为66.7%（6/9）、100%（10/10）、100%（10/10）、100%（9/9）、100%（9/9）、100%（9/9）和100%（8/8）。（5）除攻毒后4 d有2只鸭输卵管中有蛋外,其余62只鸭输卵管中均无蛋,无蛋率为96.9%（62/64）。（6）攻毒后4-10 d,96.9%（62/64）鸭的卵泡变形,96.9%（62/64）鸭的卵泡出血,95.3%（61/64）鸭的卵泡变形和出血,34.4%（22/64）卵泡破裂。【结论】（1）确定卵巢病理变化检查时间为攻毒后7-8 d;（2）具有变形或出血病变之一,判病变卵泡。输卵管内无蛋且有3个及以上病变卵泡,判为病变卵巢。     

鸭出血性卵巢炎病毒血症研究

【目的】阐明鸭出血性卵巢炎病毒（DHOV-HB株）感染鸭后的病毒血症,为深入了解鸭出血性卵巢炎的发病机理、诊断和疫苗研究提供依据。【方法】24只250日龄北京鸭芯片标记后分别经口感染100倍稀释的DHOV-HB株（3×10⁴ELD₅₀）,并设空白对照组15只,同等条件下分别在隔离器内饲养,逐日观察10日,各组每日经翅静脉采集10只鸭血液（尽可能采集同一只鸭血液）,用于病毒分离和抗体测定。将攻毒后1-10 d的血清样本经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚,每份血清以0.1 mL/胚的剂量接种5枚SPF鸡胚,鸡胚接种后置于37℃条件下继续孵化,每日定时照胚2次,及时收获并统计24-168 h之内死亡的鸡胚,死亡鸡胚胚体经剪碎,研磨,离心后采用RT-PCR的方法检测病毒核酸,有1枚及1枚以上死亡鸡胚,且DHOV病毒核酸检测阳性,即将该鸭判为病毒分离阳性。同时采用中和试验测定攻毒后4-10 d的血清抗体,每个血清稀释度接种5枚SPF鸡胚。鸡胚接种途径及特异性死亡的判定方法同上。判定标准如下：血清原液保护80%（4/5）以上的鸡胚判为抗体阳性,保护20%-60%（1/5-3/5）的鸡胚判为抗体可疑,不保护鸡胚（0/5）判为抗体阴性。【结果】试验鸭感染DHOV后的病毒血症和免疫反应密切相关。感染后1-3 d,病毒血症出现并达到高峰,病毒分离均100%（10/10）阳性;4-6 d病毒分离率开始下降,分别为90%（9/10）、70%(7/10)和30%（3/10）阳性;7-10日血清中不再存在病毒,均为阴性(0/10)。中和试验结果表明攻毒后4 d,血清中病毒分离率下降的同时血清中即可能存在较低滴度的抗体,鸡胚死亡时间延后,此时抗体100%（10/10）阴性;攻毒后6 d的血清抗体80%（8/10）阴性,20%（2/10）可疑;攻毒后7 d 70%（7/10）阳性,10%（1/10）阴性,20%（2/10）可疑;攻毒后9 d 90%（9/10）阳性,10%（1/10）可疑;攻毒后10 d 100%（10/10）阳性。空白对照组血清病毒分离（1-10 d）和抗体检测（4-10 d）均为阴性。【结论】（1）DHOV口服感染成年鸭后,1-3 d日血清病毒分离率最高,感染后4 d 病毒分离率开始下降,感染后7 d血清病毒分离阴性。感染后7 d抗体70%（7/10）阳性,感染后10 d 100%（10/10）阳性;（2）病毒血症的持续时间与特异性免疫应答密切相关。