绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析

本试验旨在获得中国美利奴羊成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）基因的编码区（CDS）全长序列并进行生物信息学分析，随后对FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达特征进行分析，明确其在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达模式，为进一步研究FGF10 mRNA表达水平与中国美利奴羊毛囊生长发育的表达调控机制奠定理论基础。采用PCR扩增获得中国美利奴羊FGF10基因CDS，并克隆到zero PCR@^TM-Blunt进行测序验证；利用实时荧光定量PCR技术检测FGF10在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达差异。结果表明，绵羊FGF10基因CDS长度为696 bp（序列上传GenBank，获得登录号：MT872422），编码231个氨基酸，与牛和山羊的氨基酸序列同源性达100%，存在1个信号肽和1个跨膜结构域，其为分泌通路信号蛋白；实时荧光定量PCR分析表明，FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中均表达，在毛囊发育第85天表达最高，显著高于其他毛囊发育时期（P<0.05）。本研究获得中国美利奴羊FGF10基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特征，生物信息学分析发现，FGF10基因编码区序列具有物种间的保守性，同时FGF10在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达，由此表明，FGF10基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要的生物学作用。     

慢病毒生产卵泡抑素转基因绵阳PCR检测方法的建立(英文)

[目的]建立稳定快速的慢病毒转基因羊DNA水平检测方法。[方法]采集初生转基因羔羊的子叶、脐带、尾组织以及死亡羔羊的全身各组织,提取基因组DNA作为模板进行PCR检测,以Follistatin基因N+D1片段特异性引物进行PCR检测;同时,对慢病毒载体的CMV启动子、5’-LTR等结构元件进行PCR检测;提取死亡羔羊的全身组织以及转基因羔羊的活体肌肉组织总RNA,进行RTPCR检测。[结果]采用试剂盒提取的基因组DNA比常规方法提取的DNA快速、高效,且更易被检测,扩增时的引物采用载体上游与目标基因下游的组合大大增加了检测的特异性,避免了内源性目标基因的干扰而造成假阳性;初生转基因羔羊的尾组织可作为PCR检测的组织样品,其结果可靠、准确;对CMV启动子及5’-LTR等结构元件作PCR检测为转基因动物的安全性考察提供了数据,同时验证了转基因羔羊目的基因的检测结果;对转基因羔羊肌肉组织提取总RNA后进行RT-PCR检测,其中有3只羔羊没有检测到转录产物,其他均有转录。[结论]该研究建立的转基因绵羊PCR检测方法高效、快速且准确,为进一步蛋白水平检测提供试验依据,也为建立转基因绵羊系统性多层次的检测方法奠定基础,还为转基因绵羊的安全监测提供了稳定的技术平台。     

添加Tween 20和Tween 80对绵羊瘤胃消化代谢的影响

选取装置永久性瘤胃瘘管和十二指肠瘘管的中国美利奴绵羊,采用5×5拉丁方试验设计,在饲喂玉米秸秆绵羊日粮中分别添加5,10 g/d Tween 20或3,6 g/d Tween 80,以空白为对照,以研究不同水平的非离子表面活性剂Tween 20和Tween 80对绵羊瘤胃消化代谢的影响.结果显示与对照组相比,添加Tween后绵羊玉米秸秆的自由采食量以及各营养物质的自由采食量差异不显著(P》0.05);但瘤胃液pH值平均降低0.05～0.11;还原糖平均浓度分别增加15.69%,15.69%和14.71%.添加Tween有提高乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸平均浓度的趋势.添加3 g/d Tween 80后乙酸和总挥发性脂肪酸的平均水平均高于其它各组,其中较对照组分别提高6.7%(P＜0.01)和5.2%(P＜0.01),其它各组间差异不显著.添加Tween对瘤胃液中氨态氮浓度、原虫数量以及干物质和半纤维素前胃消失率无显著影响,但纤维素在前胃的消失率由57%增加到60%(59.33%～60.01%)左右.添加3 g/d Tween 80后粗蛋白到达小肠的量较对照组增加14.20%,到达小肠率由77.89%增加到87.55%.以上结果提示非离子表面活性剂Tween 20和Tween 80主要通增加纤维素在前胃的消失率和乙酸生成的途径对瘤胃发酵进行调控.     

绵羊MSTN基因启动子区SNPs分析

采用测序和PCR-RFLP的方法,分析了MSTN基因启动子区在7个品种绵羊中的单核苷酸多态性,结果表明:存在2个SNP位点(-959T/C,-784G/A),表现为6种基因型(TT、TC、CC、GG、GA、AA),在-959T/C位点中,国外肉用绵羊品种陶赛特、德国肉用美利奴及我区的巴士拜羊,TT为优势基因型,地方品种绵羊巴音布鲁克羊、多浪羊和阿勒泰羊在该位点中CC为优势基因型,经χ2检验,其群体的基因频率和基因型频率均处于Hardy-Weinberg平衡状态,群体遗传多态性分析表明,这6个绵羊品种中群体的多态信息含量(PIC)均处于0.25～0.50之间,为中度多态,特克赛尔羊在该位点未发生突变。在-784G/A位点中,除陶赛特与特克赛尔羊在该位点未发生突变,其他5个品种绵羊优势等位基因均为G等位基因。经χ2检验后,其群体的基因频率和基因型频率均处于Hardy-Weinberg平衡状态,群体遗传多态性分析表明,多浪羊、巴士拜羊和巴音布鲁克羊的群体多态信息含量(PIC)均处于0.25～0.50之间,为中度多态,而阿勒泰羊和德国肉用美利奴的群体多态信息含量(PIC)小于0.25,为低度多态。     

新疆褐牛，中国荷斯坦POUIF1基因第六外显子多态性与产奶量关联分析

[目的]为了研究POUIF1基因第六外显子多态性与产奶量的关系。[方法]以新疆褐牛,中国荷斯坦为研究对象,利用PCR—RFLP对POU1F1基因第六外显子的多态性及其与产奶量的相关性进行了分析。[结果]表明：新疆褐牛,中国荷斯坦牛的群体在该位点分别检测到2种等位基因A／B,频率分别为：0．4a／0．57,0．aa／0．67,B等位基因是优势等位基因。[结论]在新疆褐牛群体中,BB型个体的产奶量显著高于AA型,在荷斯坦奶牛中BB型比AA,AB型的产奶量高,但差异不显著。     

南疆白绒山羊微卫星多态性及其与部分经济性状相关性的研究

作者研究了7个微卫星标记在2个南疆绒山羊群体中的遗传多样性,并用SAS中GLM过程分析了抓绒量、抓绒体重、绒纤维平均直径、绒纤维直径变异系数、净绒率和绒丛长度6个经济性状的标记效应及群效应。结果表明,在南疆绒山羊群体中,等位基因数为4～8个,多态信息含量为0.3186～0.7930,杂合度为0.3344～0.8175。抓绒体重和净绒率存在群效应,BMS 2782位点的A、C、I三个基因型和IDVGA 64位点的B基因型为绒丛长度的优势基因型,LSCV 13位点的B基因型为产绒量的优势基因型。     

多山梨醇酯对玉米秸秆体外发酵活力的影响

采用体外培养技术研究添加0.2%的多山梨醇酯20、40、60和80对玉米秸秆体外发酵活力的影响。结果表明:多山梨醇酯60和多山梨醇酯80能够显著提高玉米秸秆体外发酵24h的累积产气量。与对照组相比,多山梨醇酯60组和多山梨醇酯80组24h累积产气量分别提高5.68%(P<0.05)和9.02%(P<0.05)。添加多山梨醇酯对玉米秸秆的发酵模式没有显著影响,但添加多山梨醇酯60和多山梨醇酯80可增强玉米秸秆在体外的发酵强度。除多山梨醇酯20外,添加其它多山梨醇酯使玉米秸秆干物质降解率较对照组提高5.2~8.1%(P<0.05),有机物降解率有提高的趋势。在发酵24h结束时,添加多山梨醇酯40、60和80均使氨态氮浓度下降,还原糖和MCP升高,对pH和总挥发性脂肪酸无影响。其中,多山梨醇酯60和多山梨醇酯80组还原糖浓度分别比对照组提高7.54%(P<0.05)和7.26%(P<0.05)。多山梨醇酯80组MCP较对照组提高15.93%(P=0.061)。在体外培养条件下,多山梨醇酯60和80可促进玉米秸秆的降解。这说明,多山梨醇酯60和多山梨醇酯80可作为一种新型的反刍动物瘤胃发酵调控剂。     

特克赛尔羊×阿勒泰羊F2代部分肉质性状的全基因组关联分析

本研究测定了462只特克赛尔羊×阿勒泰羊杂交F2代羊背最长肌的肉质性状，利用全基因组关联分析（GWAS）方法初步筛选肉质性状（熟肉率、失水率）的候选基因，并通过QQ-plot图对群体层化效应进行了检测。结果表明，以上肉质性状群体层化分析没有发现明显的整体系统偏差，也不存在明显群体层化效应。关联分析结果表明共有16个SNP位点达到基因组显著水平，其中与熟肉率显著相关的位点8个，与失水率显著相关的位点8个。根据基因注释和文献检索结果，推测DOCK4、AOAH和CREB5基因可作为影响绵羊熟肉率的候选基因，所筛选出的候选基因主要通过调控肌纤维类型、参与肌肉生长过程等途径影响熟肉率；推测PRKCE和PRKG1基因可作为影响绵羊失水率的候选基因，筛选出的候选基因主要通过调控细胞分化、肌肉收缩、脂肪生成及参与肌动蛋白细胞骨架等作用而影响失水率。本研究结果将为改良绵羊肉质嫩度、多汁性提供候选分子标记，为地方品种绵羊标记辅助选择提供新的思路。     

新疆褐牛,中国荷斯坦POU1F1基因第六外显子多态性与产奶量关联分析

[目的]为了研究POU1F1基因第六外显子多态性与产奶量的关系.[方法]以新疆褐牛,中国荷斯坦为研究对象,利用PCR-RFLP对POU1F1基因第六外显子的多态性及其与产奶量的相关性进行了分析.[结果]表明: 新疆褐牛,中国荷斯坦牛的群体在该位点分别检测到2种等位基因A/B,频率分别为:0.43/0.57,0.33/0.67,B等位基因是优势等位基因 .[结论]在新疆褐牛群体中,BB型个体的产奶量显著高于AA型,在荷斯坦奶牛中BB型比AA,AB型的产奶量高,但差异不显著.     

绵羊Noggin基因的克隆、序列分析与原核表达

根据同源序列克隆原理设计一对引物,以绵羊脑组织总RNA的反转录产物为模板,利用RT-PCR扩增绵羊Noggin基因cDNA全长编码区,克隆到pMD-18T载体。测序验证后,提取pT-Noggin质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收目的条带,亚克隆到pET41a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。序列分析表明,绵羊Noggin基因的cDNA全长编码区(GenBank登录号为FJ751853)为699bp,编码232个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸序列同源性达到95%以上。SDS-PAGE结果显示,诱导表达的融合蛋白大小为60ku,与预期蛋白大小一致。Western blot检测结果显示,该蛋白为His融合蛋白。说明成功克隆了绵羊Noggin基因的编码区序列,构建了原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。