羽衣甘蓝ARC1的基因分离、表达及与SRK相互作用的分析

 以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S_13-b S_13-b）为试验材料,利用RT-PCR的方法分离其ARC1基因cDNA序列（命名为BoARC1,GenBank登录号为EU344909）。BoARC1 cDNA序列中含有1个1 992 bp的开放读码框（ORF）,编码1个含有663个氨基酸的蛋白质。羽衣甘蓝BoARC1与油菜BnARC1的氨基酸序列具有94%的一致性;Southern杂交结果显示BoARC1在基因组中只存在单一拷贝;Northern杂交结果显示BoARC1特异性地在柱头组织中表达;在酵母双杂交试验分析中,BoARC1能够与SRK₃、SRK _13-b和SRK₉₁₀的胞内激酶域发生相互作用。     

羽衣甘蓝ARC1 蛋白的原核表达、纯化及泛素连接酶活性分析

 ARC1 是植物特有的一类含有U-box/ARM 结构域的蛋白,在芸薹属植物自交不亲和 （self-incompatibility,SI）信号转导中起着正向调控因子的作用。将羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）BoARC1 编码区的序列连接到原核表达载体pET-14b 上,通过酶切鉴定和测序分析,构建pET-14b- BoARC1 表达质粒;将获得的阳性表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）pLysS 中,利用IPTG 进行诱导表达。SDS-PAGE 结果显示,在分子量69 kD 处有BoARC1 蛋白特异性地诱导表达;利用Ni2+-NTA 树脂通过亲和层析的方法获得BoARC1 融合蛋白。在泛素激活酶（E1）、泛素结合酶UBC7（E2）和泛素 体外泛素化反应后,通过免疫印迹的方法检测,显示出BoARC1 融合蛋白能够将底物进行多泛素化修饰; 当U-box 中保守位点第323 位Pro 突变为Ala 或其他泛素化组分缺少时,底物不能被泛素化修饰。     

羽衣甘蓝ARC1的抗体制备及蛋白表达分析

ARC1是芸薹属植物自交不亲和(Self-incompatibility,SI)信号复合体下游传递因子,特异性地介导SI信号传递。利用原核表达系统对羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)ARC1的全长蛋白(1~663 aa,BoARC1-F)、UND结构域蛋白(1~279 aa,BoARC1-N)和ARM结构域蛋白(361~663aa,BoARC1-C)进行重组表达。SDS-PAGE结果显示这3种蛋白分别在分子量68、33和38 kD处特异性地诱导表达。利用Ni~(2+)-NTA树脂亲和层析技术获得重组蛋白。将BoARC1-C蛋白免疫小鼠并通过细胞融合技术制备单克隆抗体,获得2株单克隆抗体。交叉反应试验结果显示制备的单克隆抗体具有ARC1识别特异性。通过免疫印迹技术检测BoARC1在不同组织和不同发育阶段柱头中的表达,结果显示BoARC1特异性地在羽衣甘蓝柱头中表达,而且在开花阶段的柱头表达量最高。     

羽衣甘蓝花粉SCR13-b基因的分离及其功能分析

 以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala) S_13-bS_13-b自交不亲和系为试验材料, 分离了控制花粉自交不亲和基因———S_13-b单倍型富含半胱氨酸基因(SCR_13-b) , GenBank收录号为EF577028。SCR_13-b cDNA序列含有237 bp的开放读码框(ORF) , 编码一个含78个氨基酸的蛋白。SCR_13-b gDNA含有一个758 bp的内含子, 内含子5′供体位点和3′受体位点边界序列符合GU2AG规则; DNA blot分析表明SCR_13-b在基因组中只有单一拷贝; 授粉生物活性分析试验显示原核表达SCR132b融合蛋白能够启动SI反应, 抑制杂交亲和花粉的萌发和生长。     

羽衣甘蓝Exo70A1基因的分离及表达分析

 以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S13-b S13-b）为试材,从柱头中分离Exo70A1基因,命名为BoExo70A1,GenBank登录号为JF919716。BoExo70A1全长cDNA序列为2 184 bp,包含56 bp的5′非编码区,211 bp的3′非编码区和一个长度为1 917 bp的开放读码框（ORF）,对应编码一个含有638个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列比对分析表明,羽衣甘蓝BoExo70A1与油菜BnExo70A1、拟南芥AtExo70A1的一致性分别为99%和94%;BoExo70A1基因结构含12个外显子和11个内含子,内含子5′供体位点和3′受体位点边界序列符合GU-AG规则;Southern杂交结果显示,BoExo70A1在羽衣甘蓝基因组中存在多拷贝;Northern杂交结果显示BoExo70A1在茎、叶、花瓣、花药、柱头、花柱和子房中表达,而且在叶中的表达量最低。     

羽衣甘蓝泛素结合酶ubc7基因分离、原核表达及纯化

为分离羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)泛素结合酶7(ubc7)基因,探讨Ubc7重组蛋白的原核表达及纯化。利用CTAB的方法提取羽衣甘蓝柱头总RNA,通过RT-PCR的方法分离ubc7基因,将编码ubc7基因的cDNA序列亚克隆到pET-14b原核表达载体中,将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中,利用IPTG进行诱导表达,并通过Ni2+-NTA树脂进行亲和层析的方法纯化重组蛋白。结果表明,获得的Boubc7含有一个长度为501 bp的开放读码框,编码一个含有166个氨基酸残基的蛋白质。预测BoUbc7的相对分子质量约为18.7 kDa,理论等电点(pI)为5.35。利用IPTG诱导的细菌蛋白中,SDS-PAGE显示出在分子量大小23 kDa处有蛋白特异性的表达,这与预测的His6融合的BoUbc7蛋白分子量相符;利用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析纯化后,成功获得了BoUbc7融合蛋白。该试验分离了羽衣甘蓝ubc7基因,并通过原核表达系统获得了BoUbc7重组蛋白,为进一步分析其生物学功能奠定了基础。     

羽衣甘蓝自交不亲和系的选育及S_(13b)单倍型的鉴定

该文采用亲和指数法(种子数/自交授粉花朵数)分别在羽衣甘蓝‘赤兔’和‘白波’栽培品种的自交后代中,经过3年的自交选育获得1个自交不亲和系4·1·1和一个自交亲和系3·2·3·由于在芸苔属植物F1代杂交种的生产和自交不亲和分子机制的研究方面S单倍型鉴定是必要的,因此在该文中我们采用了PCR方法利用引物PK1和PK4获得了BoSRKx的基因组序列,此序列的大小为919bp.经过数据库检索比对后发现BoSRKx的序列与BoSRK13b的序列完全一致.通过反转录PCR的方法获得了BoSRKx的cDNA序列,结果发现BoSRKx和BoSRK13b的序列在转录水平上也是完全一致的;另一方面,我们采用SCR保守信号肽编码区和NotⅠ-oligo(dT)设计的引物获得了BoSCRx的cDNA序列,经过数据库的检索比对后发现BoSCRx的序列比BoSCR13的序列只多出3个连续的碱基.根据上述结果我们推断出Sx单倍型就是S13b单倍型;最后,通过遗传分析结合PCR-RFLP方法和DNAblot方法对自交不亲和系进行了S13b纯合体的鉴定.     

羽衣甘蓝ARC1与Exo70A1蛋白相互作用结构域的分析与鉴定

为阐明羽衣甘蓝自交不亲和信号传递因子ARC1与下游底物Exo70A1相互作用的结构域,利用酵母双杂交系统进行检测与分析。将羽衣甘蓝BoARC1、BoARC1-N端（1 ~ 279 aa,含有UND结构域）及BoARC1-C端（280 ~ 663 aa,含有U-box结构域和Arm repeat结构域）的序列分别构建到pGBKT7载体中,获得BD-ARC1、BD-ARC1-N和BD-ARC1-C重组质粒。将羽衣甘蓝BoExo70A1、BoExo70A1-Δ1（1 ~ 85 aa）、Exo70A1-Δ2（1 ~ 270 aa）及Exo70A1-Δ3（271 ~ 638 aa,含有Exo70结构域）的序列分别构建到pGADT7载体中,获得AD-Exo70A1、AD-Exo70A1-Δ1、AD-Exo70A1-Δ2和AD-Exo70A1-Δ3重组质粒。将获得的重组质粒分别共转化到酵母Y187菌株中,在双缺陷（-Leu-Trp）酵母培养基中培养与生长。β-gal显色检测结果表明,共转BD-ARC1-N/BoExo70A1-Δ1或BD-ARC1-N/BoExo70A1-Δ2的酵母在滤纸上显示蓝色,这说明BoARC1的N端与BoExo70A1的N端介导了两者的相互作用。