抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

抗凋亡药物在精液保存中的应用研究进展

抗凋亡药物的研究无论在疾病治疗还是在抗毒、抗衰老方面都有十分重要的意义.在简述近年来抗凋亡药物在医学领域研究概况的基础上,重点综述了其在动物和人精液保存中的研究进展.     

农村生活污水分散式处理现状与问题探讨

农村生活污水治理是改善农村人居环境、实施乡村振兴战略的重要举措和全面建成小康社会的内在要求。基于农村生活污水分散式处理工艺的现状与问题的分析,对广东省农村生活污水处理工艺模式进行了实地调研,选取广州市增城区某村的厌氧+人工湿地工艺、珠海市斗门区某村的土地渗滤工艺、中山市横栏镇某村的MBR工艺和佛山市顺德区某村的A~2O工艺,进行定点检测,分析4种工艺对生活污水COD、NH_4~+-N、TN和TP的处理情况,探讨4种工艺的运行效果及其成因。结果表明,4种工艺总体上污染指标进水浓度波动较大,存在明显的峰值特征,去除率日变化系数较大,大部分污染指标的日均去除率低于60%。4种工艺的COD处理效果基本达标,但是氮磷超标较多,A~2O工艺和厌氧+人工湿地工艺的出水NH_4~+-N、TN和TP浓度未达到国家一级B标准,MBR工艺出水TP浓度未达到国家一级B标准,其原因与C/N过低、处理设施运行维护不善等有关。研究表明,对农村生活污水处理工艺的选择应遵循因地制宜的原则;使用中应加强处理设施维护管理,提高生活污水氮磷处理效率和长期持效性。     

他克林对猪精子冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响

旨在研究他克林对猪精液冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响机制。手握法采集12头18～24月龄健康杜洛克种公猪精液,在其冷冻保存稀释液中加0.10mmol/L他克林并冷冻保存,检测冻后精子活率、质膜完整率、顶体完整率和畸形率、线粒体膜电位、DNA完整性,同时利用试剂盒检测总抗氧能力、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、总胆固醇含量、丙酮酸含量及己糖激酶活性。结果表明,与鲜精相比,冻融后精子活率和质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位、DNA完整性、抗氧化能力及糖代谢指标均极显著下降,畸形率极显著升高。与空白组相比,他克林显著提高冻后精子顶体完整率、DNA完整率、超氧化物歧化酶、丙酮酸含量;极显著提高精子活率、质膜完整率、线粒体膜电位、总抗氧能力、丙二醛含量、总胆固醇含量及己糖激酶活性,极显著降低畸形率。总之,猪精液冷冻前添加浓度为0.10 mmol/L的他克林可能通过提高抗氧化能力和糖代谢水平改善冻融后猪精子的质量。     

奈达铂联合长春瑞宾治疗晚期头颈部癌37例

目的:观察奈达铂和长春瑞宾(NN方案)联合化疗晚期头颈部癌的有效性和安全性。方法:晚期头颈部癌患者37例(鼻咽癌25例、甲状腺癌8例、舌癌2例、牙龈癌2例),采取NN方案化疗2～4周期。NN方案具体用法为:奈达铂(DNP)80～100mg/m2,溶于生理盐水至少300ml,静脉滴注(60min以上),d1;长春瑞宾(NVB)25mg/m2,生理盐水50～100ml稀释,并在短时间内(6～10min)静脉冲入,d1、d8,注意血象和造血细胞因子支持。每3周重复。每2周期化疗结束行疗效评价。结果:完成化疗4个周期的患者共32例,3个周期的3例,2个周期的2例;完全缓解(CR)10例,部分缓解(PR)15例,稳定(SD)9例,进展(PD)3例,有效率为(CR+PR)67.6%。晚期头颈部癌患者37例的一般状况均在NN方案化疗后得到改善,骨髓抑制和静脉炎是主要不良反应。结论:NN方案联合化疗晚期头颈部癌具有较好的疗效,生存期延长,值得进一步观察研究。     

盐胁迫下沙柳幼苗的生理生化变化

以沙柳幼苗为试材,研究了0(对照)、50、100、150mM NaCl胁迫对沙柳幼苗的形态变化、酶液宏观变化、酶活性变化及内源激素含量变化的影响。结果表明:100mM NaCl盐浓度及以下胁迫对沙柳幼苗近乎无影响,ABA、IAA、GA的含量相对平稳,无太大变化,通过测定内源激素的含量可发现,100mM NaCl盐浓度时沙柳幼苗长势出现下降,100mM NaCl盐浓度以上的胁迫对沙柳幼苗的影响显著,沙柳幼苗所能承受NaCl迫害的最高Na盐浓度处于100mM NaCl和150mM NaCl之间。150mM NaCl盐浓度胁迫时,其在第1天和第3天间代谢紊乱程度达到其可耐受的极限程度,随后的几天植株走向死亡。同时沙柳幼苗在濒临死亡时其ABA含量无大幅度升高,这与常见植物有所不同。而IAA、GA的含量呈现出在短时间内迅速达到最大含量,随后的几天内含量有所降低。在极高浓度的NaCl胁迫下,沙柳幼苗的SOD活性在短时间内迅速下降后持续大幅度上升,沙柳幼苗死亡时,SOD活性达到最高。沙柳幼苗受到NaCl胁迫时,其CAT比SOD和POD敏感,CAT活性受到的影响更显著。     

丙氨酸、半胱氨酸及精氨酸对牛精液冷冻效果的影响

在常用的果糖-柠檬酸钠-卵黄-甘油组合稀释液的基础上,分别添加不同浓度的丙氨酸(0.25、0.50、0.75、1.00 mmol·L-1)、半胱氨酸(0.25、0.50、0.75、1.00 mmol·L-1)和精氨酸(2.50、5.00、7.50、10.00mmol·L-1),以观察3种氨基酸在牛精液冷冻中应用的最佳浓度.再以最佳浓度的3种氨基酸进行两两或三重组合,与3种氨基酸单一应用进行效果对比,检测这些氨基酸对牛精液冷冻后质量是否有协同作用.结果表明,无论单一或合并应用丙氨酸、半胱氨酸及精氨酸,均未能显著提高精液的冻后质量.但相同的处理应用于不同的公牛可能会有显著不同的效果.     

丙酮酸盐对牛精液冷冻效果的影响

在常用的果糖-柠檬酸钠-卵黄-甘油液的基础上,分别添加1.25 mmol/L或2.00mmol/L的丙酮酸钾、丙酮酸钠或丙酮酸钙,以观察丙酮酸盐在牛精液冷冻中的应用效果。冷冻前各组稀释液隔15min分2次加入,之后平衡4h。结果表明,各组精子的冻后活力、复苏率、畸形率和顶体完整率之间没有显著差异,但6个试验组的冻后活力、复苏率和对照组相比有提高趋势。     

乳铁蛋白对牛精液冷冻效果的影响

[目的]探索乳铁蛋白在牛精液冷冻中的应用效果,为乳铁蛋白在家畜精液保存中的研究与应用提供初步的参考数据。[方法]在常用稀释液(果糖-柠檬酸钠-卵黄-甘油液)的基础上,分别添加不同浓度(250、500、1000mg/L)的乳铁蛋白,观察乳铁蛋白对牛精液冷冻效果的影响。[结果]3种浓度的乳铁蛋白对精子的冻后活力、复苏率、VAP、VSL、VCL、畸形率、顶体完整率及低渗肿胀率均没有显著影响。[结论]在该试验条件下,乳铁蛋白未能显著提高牛精液的冻后质量。     

鸦胆子对鸡球虫卵囊孢子化率及子孢子的直接杀伤作用

自苦木科植物鸦胆子中提取了鸦胆子油(BJ-PE)、鸦胆子乙醇萃取物(BJ-EE)和鸦胆子水提物(BJ-WE),通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)检测了鸦胆子油的化学成分,并探讨了鸦胆子提取物对鸡球虫卵囊孢子化的影响及对子孢子的直接杀伤作用。结果显示,通过GC-MS法鉴定出鸦胆子油中含有32种化合物,主要为脂肪酸、脂肪醇类化合物及少量芳香族化合物。鸡球虫卵囊经BJ-EE、BJ-WE和Bruceine-D处理后,未孢子化率升高,其中8g/L BJ-WE处理组中未孢子化卵囊的数量显著高于对照组(P0.05)。子孢子经BJ-EE和Bruceine-D处理后,数量显著减少,形态发生明显变化,表现出变短、变圆的趋势。透射电镜观察发现,子孢子或萎缩成小球,外膜轮廓模糊,淀粉粒减少;或细胞膜破裂,胞内细胞器排列混乱;或呈现哑铃型,结构扭曲。综上所述,鸦胆子提取物对鸡球虫卵囊的孢子化具有一定的抑制作用,对子孢子具有较强的直接杀伤作用,为抗球虫药物的研发提供了新选择。