MSTN基因对牛肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响

为探究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究前期利用定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析野生型蒙古牛（MG.WT）和MSTN^+/-蒙古牛（MG.MSTN^+/-）腿臀肌肌肉组织中蛋白质水平和磷酸化修饰水平的差异变化,使用已建立的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,检测设计合成的MSTN siRNA （si-MSTN）干扰效果;采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测转染si-MSTN的增殖期（GM）和分化第3天（DM3）牛骨骼肌卫星细胞中肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的mRNA和蛋白水平的表达变化,研究敲低MSTN表达对肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响。结果显示,在MSTN^+/-蒙古牛肌肉组织中共鉴定到16个肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因表达丰度上调;转染si-MSTN细胞中的MSTN表达水平极显著降低（P<0.01）;在转染si-MSTN的GM期牛骨骼肌卫星细胞中,肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因ENAH、ACTN4和Cdc42的mRNA水平均显著升高（P<0.05）,PFN1、RhoA和ACTN4的蛋白水平均显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）;在转染si-MSTN的DM3牛骨骼肌卫星细胞中,ENAH、CFL1、SCIN和Cdc42基因mRNA水平均显著升高（P<0.05）,RhoA基因mRNA水平极显著升高（P<0.01）,PFN1和ACTN4的蛋白水平均显著升高（P<0.05）。结果表明,干扰MSTN可以促进肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的表达,探明了MSTN可能通过介导肌动蛋白细胞骨架调节通路影响牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的分子机制,为进一步研究MSTN对牛成肌分化的调控机制提供参考。     

circADAMTS16的表达谱分析及其对牛脂肪细胞分化的影响

旨在探究 circADAMTS16在牛不同组织和前体脂肪细胞中的表达水平及其对牛脂肪细胞分化的影响，为进一步研究circRNA在细胞分化和脂肪组织发育过程中的调控作用提供依据。采用组织块法分离培养牛原代前体脂肪细胞并诱导分化，模拟牛脂肪组织生长发育过程；通过qRT-PCR检测 circADAMTS16在牛不同组织（心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪）和脂肪细胞分化不同阶段（0 d、2 d、4 d、8 d、10 d）的表达水平；构建 circADAMTS16的过表达载体（pCD2.1- circADAMTS16），设计合成 circADAMTS16的小干扰RNA （si- circADAMTS16），采用（Lipofectamine3000）转染试剂将pCD2.1- circADAMTS16和si- circADAMTS16转染牛前体脂肪细胞，利用qRT-PCR法检测转染效果，同时检测脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα和 C/EBPβ的表达量变化，并进行油红O染色，综合分析干扰和过表达 circADAMTS16对牛脂肪细胞分化的影响。结果如下：①qRT-PCR检测结果表明 circADAMTS16在心脏中表达量最高，肝脏次之，脾最低；②在牛原代前体脂肪细胞分化过程中， circADAMTS16在第2天显著高表达，随后逐渐降低，在第8天时达到最低。③在牛前体脂肪细胞中过表达circADAMTST16后，脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ的表达量显著下降；油红O染色结果显示，过表达后脂滴形成数量明显少于对照组；而干扰 circADAMTS16表达后，脂肪分化标志基因PPARγ和C/EBPα表达量显著上升。综上所述， circADAMTS16对牛原代前体脂肪细胞的分化过程具有显著的调控作用，过表达 circADAMTST16可抑制牛原代前体脂肪细胞分化进程，而干扰 circADAMTS16表达可以促进牛原代前体脂肪细胞分化进程，探明 circADAMTS16对牛原代前体脂肪细胞分化的具体调控作用。     

干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选在牛骨骼肌卫星细胞（MSCs）分化前后稳定表达以及不受MSTN基因表达影响的内参基因,试验以野生组（WT）、转染干扰MSTN组（si-MSTN）和对照组（NC-MSTN）的牛MSCs作为样品,选取HMBS、B2M、GAPDH、TUBB、SDHA、18S rRNA、ACTB、RPL4、PPIA、HPRT1和YWHAZ作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR技术Ct值分析法对各候选内参基因的相对表达进行测定,首先利用3个独立评价软件geNorm、NormFinder和BestKeeper分别对各候选内参基因在野生组牛MSCs增殖期（GM）和分化第3天（DM3）细胞中的表达稳定性进行评价,筛选出前5个表达相对稳定的候选内参基因;然后以此为基础,利用相同的方法分析MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天的细胞中上述5个内参基因的表达水平和稳定性。geNorm、NormFinder分析结果均显示,HMBS、B2M、TUBB、GAPDH和ACTB在牛MSCs分化前后表达较稳定,BestKeeper分析显示ACTB和TUBB相关系数（r）排序靠前,GAPDH、HMBS和B2M排序不是很高,但是GAPDH的SD值最小,因此选择这5个候选内参基因做后续试验;在牛MSCs MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天,geNorm、NormFinder软件分析结果显示,上述5个候选内参基因中GAPDH、TUBB和B2M表达最稳定,BestKeeper分析显示TUBB相关系数排名不是最高,但其SD值最小,综合以上分析,选择TUBB作为牛MSCs干扰组和对照组增殖期和分化第3天最适内参基因。研究结果可为以后进行牛MSCs在不同生长时期以及MSTN表达被调控后基因的表达分析提供参考。     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素（MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖（DCN）为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2（si-DCN）转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期（GM）牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天（DM3）的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调（P<0.05;P<0.01）,且EdU阳性细胞率显著增加（P<0.05）,表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组（P<0.01;P<0.05）,MyHC在mRNA水平显著降低（P<0.05）,但在蛋白水平上极显著升高（P<0.01）,免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组（P<0.05）,说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

沥青混凝土路面的病害养护对策分析

高速公路路面预防性养护技术,是在高速公路建设的数量和质量要求的前提下发展起来的.预防性养护技术能够有效的提高公路养护的效果,降低高速公路的养护成本,在现代高速公路管理养护工作中得到了广泛的应用.文章在对预防性养护概念分析的基础,分析了高速公路沥青路面破坏原因,综合上述分析的基础上,提出了路面预防性养护的具体措施,为提高高速公路沥青混凝土路面的养护技术,做出了理论研究和参考.     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素(MSTN)对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖(DCN)为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2(si-DCN)转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期(GM)牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天(DM3)的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),且EdU阳性细胞率显著增加(P<0.05),表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组(P<0.01;P<0.05),MyHC在mRNA水平显著降低(P<0.05),但在蛋白水平上极显著升高(P<0.01),免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组(P<0.05),说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。