vvi-miR172s及其靶基因响应赤霉素调控葡萄果实发育的作用分析

【目的】miR172是植物生长发育的重要调节因子,阐释vvi-miR172s及其靶基因应答赤霉素在葡萄果实不同组织发育过程中的作用,从miRNA角度认识GA调控葡萄果实发育的作用机制。【方法】以‘白罗莎里奥’葡萄为材料,以miR-RACE和PCR技术克隆vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,由psRNA Target软件预测vvi-miR172s的靶基因;利用RLM-RACE技术验证vvi-miR172s剪切靶基因的裂解作用及其作用位点;采用生物信息学软件对靶基因、靶蛋白进行系统进化、序列结构分析及亚细胞定位预测;通过在线软件PLANTCARE进行启动子作用元件分析;通过qRT-PCR和芯片数据分析vvi-miR172s和靶基因在不同器官、不同发育阶段的基因表达图谱,以及应答GA₃在果实不同组织中的时空表达模式。【结果】克隆鉴定了vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,预测到VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2和VvRAP2-3四个靶基因,验证到裂解产物及其裂解位点,证明它们为vvi-miR172s的真实靶基因。序列结构分析显示,VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均含有10个外显子和9个内含子,其motif元件的种类和数量相似,均含有两个排列顺序相近的AP2蛋白结构域,表明其结构和功能具有一定的保守性;且VvAP2、VvRAP2-1和VvRAP2-2与杨树的亲缘关系较近,VvRAP2-3与大豆具有较高的同源性;靶基因蛋白二级结构均为α-螺旋,可进一步折叠为稳定的三级结构;4个靶蛋白亚细胞定位主要位于细胞核内。启动子作用元件分析发现vvi-miR172c和VvRAP2-1中含有赤霉素响应元件,表明它们可能响应赤霉素调控葡萄生长发育;芯片数据分析显示vvi-miR172c和靶基因的表达模式具有组织或器官特异性,且它们之间呈现一定的负相关,表明它们之间存在负调控作用;RT-qPCR结果显示,随着葡萄果实的发育,果皮中vvi-miR172a/b/d呈下降的表达趋势,而靶基因VvRAP2-1的表达模式相反,表明vvi-miR172a/b/d对VvRAP2-1负调控;果肉中vvi-miR172d的表达水平降低,而靶基因VvAP2的表达水平增加,表明vvi-miR172d与VvAP2呈负相关性。另外,GA₃处理改变了vvi-miR172s的靶模式,增强了果肉和果皮组织中vvi-miR172d与VvRAP2-1的负相关性,同时诱导了vvi-miR172c对VvAP2/VvRAP2-2/VvVvRAP2-3的负调控作用。【结论】VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均为葡萄miR172a/b/c/d的真实靶基因,vvi-miR172家族可能通过vvi-miR172a/b/d和vvi-miR172d分别介导靶基因VvRAP2-1和VvAP2调控果皮和果肉组织的发育过程,而vvi-miR172c和vvi-miR172d及其靶基因可能是GA调控葡萄果皮与果肉组织发育的主要作用因子。