鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析

[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病.为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定.[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析.[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株.该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU·mL-1.测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸.DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的全基因同源性为98.5％ ～99.3％.与最早分离的BYD株等相比,XZ-2012株的基因变异主要分布于E基因、NS1基因、NS2基因和NS5基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力.[结论]本试验成功分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒候选疫苗株的筛选及病毒分子流行病学研究提供了参考信息.     

日本脑炎病毒NS1’蛋白移码片段的原核表达及免疫反应性分析

通过对日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组中移码序列分析,设计合成1对引物,利用PCR扩增出NS1’移码片段,并将移码片段克隆入pET-32a表达载体中。重组质粒转化大肠杆菌BL21后,经IPTG于20℃过夜诱导,实现了目的片段的可溶性表达。对表达产物进行SDS-PAGE鉴定,可检测到分子质量约为25 ku的融合蛋白。以日本脑炎病毒野毒株和弱毒株感染小鼠血清为一抗,进行Western blot分析,原核表达蛋白仅与野毒感染小鼠血清发生特异性反应,说明该蛋白具有区分临床野毒感染和疫苗免疫的潜力。     

猪流行性乙型脑炎病毒B细胞多表位抗原的表达及免疫原性分析

流行性乙型脑炎病毒(JEV)可引起猪的繁殖障碍性疾病。本文利用基因重组技术,选取JEV prM/M、E、NS1蛋白的6个B细胞抗原表位,设计B细胞多表位基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达融合重组蛋白rMEP。纯化的rMEP免疫小鼠,通过抗体、中和抗体及亚型检测研究其免疫原性。结果表明,rMEP在上清中高效表达,Western blot结果证实rMEP具有较好的抗原性。在小鼠免疫模型中,rMEP免疫组小鼠血清中产生较高水平的针对rMEP的抗体和特异性中和抗体,且rMEP可诱导产生IgG1和IgG2a抗体,但以IgG1为主。这些结果表明,构建的JEV B细胞多表位蛋白能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答,为研究JEV的多表位疫苗提供新的思路和参考。     

2株鸭瘟病毒强毒株的分离鉴定

通过鸭胚接种,从山东和安徽两地疑似鸭瘟临床病例中分离鸭瘟病毒,分别命名为SD株和AH株。根据鸭瘟病毒疫苗株UL26-UL30的基因序列,设计引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增UL27(gB)的全基因,并对扩增的片段进行测序。结果表明,扩增片段包括完整的gB基因,长度均为3 003 bp,2株鸭瘟病毒分离株与鸭瘟病毒疫苗株的gB基因同源性均为99.8%,并且分别发生4个和2个氨基酸的变异。2分离株无血凝特性,鸭胚半数致死量DELD50分别为10-4.5/0.2 mL和10-4.35/0.2 mL,动物回归试验可致15日龄雏鸭死亡,鉴定为鸭瘟病毒强毒株。